一、熒光基礎(chǔ)知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出其他波長的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團(tuán)。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團(tuán)的激發(fā)峰值和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長比激發(fā)光更長。

熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標(biāo)記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術(shù)中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在熒光顯微技術(shù)中具體體現(xiàn)為以下幾個關(guān)鍵部件：

（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個指標(biāo)

? 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團(tuán)在特定波段范圍才能被大部分激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團(tuán)激發(fā)特征。

? 發(fā)射光譜波段的強(qiáng)度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強(qiáng)信號的發(fā)射熒光信號。

（明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功）

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個

? 激發(fā)濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

? 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團(tuán)發(fā)射的特定波段的光通過

? 二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

（明美可定制適配四家品牌，不同波段需求的激發(fā)塊）

二、熒光顯微成像的應(yīng)用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學(xué)）、礦物、材料科學(xué)等領(lǐng)域的顯微熒光觀測。①在生物學(xué)領(lǐng)域，主要借助熒光染料標(biāo)記，可準(zhǔn)確和詳細(xì)地識別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分。②在礦物學(xué)領(lǐng)域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學(xué)，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導(dǎo)體領(lǐng)域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

（MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片）

熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用是廣泛也是復(fù)雜的，主要是對細(xì)菌、細(xì)胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進(jìn)行標(biāo)記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進(jìn)行標(biāo)記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標(biāo)記的位置，二是該染料對應(yīng)的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對核酸、聚糖進(jìn)行染色，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測。以下根據(jù)染料結(jié)合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應(yīng)用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標(biāo)記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術(shù)利用抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的特性，主要有兩種方式：一是利用內(nèi)源熒光信號，即通過克隆技術(shù)用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標(biāo)記的抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。

? FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機(jī)熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質(zhì)上的基團(tuán)結(jié)合，主要用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。

? TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質(zhì)結(jié)合。

? 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，從而讓標(biāo)記顯影時背景弱，信號強(qiáng)。除細(xì)胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學(xué)顯影、小動物體內(nèi)成像等。

? Alexa Fluor系列：屬于帶負(fù)電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標(biāo)識涵蓋了對應(yīng)的激發(fā)波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標(biāo)記核酸。同蛋白質(zhì)一樣，對核酸進(jìn)行標(biāo)記與研究同樣有重要意義，如對細(xì)胞核（主要成分為核酸）進(jìn)行染色標(biāo)記可以判斷細(xì)胞的數(shù)量和位置。

? DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時，在358nm處有一個吸收峰值，在461nm處有一個發(fā)射峰值，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可與RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果。DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜，因此被廣泛用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

? Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍(lán)靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細(xì)胞膜，被廣泛用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色。

? PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細(xì)胞膜的DNA染色劑。與核酸結(jié)合后，激發(fā)波長為538 nm，發(fā)射波長為617 nm。由于該染色劑無法進(jìn)入完整的細(xì)胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻(xiàn)
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）離子成像：研究細(xì)胞中各種離子的流動與分布對細(xì)胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結(jié)合形成熒光團(tuán)，利用光譜特征檢測對應(yīng)離子的分布狀態(tài)。

三、熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應(yīng)用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行成像的過程中，不僅要考慮成像的質(zhì)量，包括分辨率、對比度、熒光信號強(qiáng)弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術(shù)應(yīng)用中的常見挑戰(zhàn)與應(yīng)對方法：

汞燈需搭配帶計時器的復(fù)雜控制箱來使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強(qiáng)，但使用有很多麻煩，首先需要預(yù)熱，然后光強(qiáng)靠ND濾鏡調(diào)節(jié)，壽命較短可能就200小時，在壽命用完前還會有光強(qiáng)衰減問題，需要調(diào)整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應(yīng)用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強(qiáng)更穩(wěn)定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四家品牌的濾光片組

（2）濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會對熒光效果產(chǎn)生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四家品牌顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四家品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

（MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像）

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學(xué)領(lǐng)域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)分子在與氧反應(yīng)時吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細(xì)胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應(yīng)對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強(qiáng)和盡可能短的激發(fā)時間，需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時間的熒光成像中，這種情況需要提高相機(jī)的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

（單通道熒光拍攝，經(jīng)軟件合成多色熒光圖像）

（4）多色熒光成像：在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，尤其是在對活細(xì)胞標(biāo)記成像時，需同時對多種物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并在一個圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標(biāo)記時會出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對于多色熒光成像，有兩種應(yīng)對思路，一是針對每種染料使用對應(yīng)的單通道窄帶濾光片，后通過軟件進(jìn)行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點(diǎn)是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實現(xiàn)一組濾光片同時觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區(qū)分。

（雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時觀察到B\G兩種熒光信號）

來源：https://www.mshot.com/article/1527.html

納米銀粒子很小，才幾十納米，通常會用到電子顯微鏡。不過，此次，香港中文大學(xué)老師只需要觀察納米銀顆粒分布，不需要清晰觀察細(xì)節(jié)，同時后期需升級熒光觀察，因此深圳區(qū)域工程師推薦了金相顯微鏡MJ43BD搭配2000萬像素顯微鏡相機(jī)MDX10，現(xiàn)場演示了金相樣品效果，獲得用戶認(rèn)可。

金相顯微鏡MJ43，配備半復(fù)消色差的明暗場物鏡和六孔轉(zhuǎn)盤式落射模塊，具備良好的成像質(zhì)量和擴(kuò)展能力，對于功能和擴(kuò)展要求更高的老師很適合，標(biāo)配支持明場和暗場觀察，根據(jù)工業(yè)和材料學(xué)的不同應(yīng)用，還能通過模塊化組合，實現(xiàn)偏光、熒光、DIC等觀察方式。

金相顯微鏡MJ43可應(yīng)用于半導(dǎo)體、FPD、電路板、金屬材料等制造領(lǐng)域，適用于教學(xué)及研究方面

您若對金相顯微鏡感興趣或存在疑問，歡迎與我們聯(lián)系，我們將竭誠為您服務(wù)！

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來源：https://www.mshot.com/article/1741.html

倒置熒光顯微鏡MF52-N應(yīng)用于細(xì)胞

幾年來科學(xué)家正在開發(fā)細(xì)胞療法，希望能治療多種疾病和疑難雜癥。這就需要質(zhì)量控制和各種有關(guān)儀器設(shè)備來支持免疫療法和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。近期，明美上海區(qū)域安裝倒置熒光顯微鏡MF52-N，觀察mcherry熒光，應(yīng)用于細(xì)胞治療。

倒置熒光顯微鏡MF52-N下，細(xì)胞均勻分布，生長狀態(tài)良好。作為一種新興的治療方式，細(xì)胞治療在眾多疾病特別是癌癥、遺傳疾病、傳染病的治療中展現(xiàn)出良好的效果。而明美倒置熒光顯微鏡MF52-N為治療提升效率與提高準(zhǔn)確性。

倒置熒光顯微鏡MF52-N配備數(shù)顯LED熒光模塊，可實現(xiàn)三通道熒光激發(fā)，可選BGUYR等不同通道，激發(fā)光強(qiáng)直觀可視并獨(dú)立記憶，可用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測等科研應(yīng)用。

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倒置熒光顯微鏡下的免疫熒光細(xì)胞：探索微觀世界的奧秘

顯微鏡觀察免疫熒光細(xì)胞是一種重要的實驗方法，用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等成分的表達(dá)、功能和相互作用，目前，免疫熒光顯微鏡已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可或缺的工具之一。

在倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時，需要選擇合適的顯微鏡參數(shù)，以確保觀察的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。例如，光源的種類、顯微鏡的分辨率、物鏡放大倍數(shù)和熒光通過率等因素。此外，在進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞時，需要選擇合適的熒光強(qiáng)度和熒光顏色，以避免對觀察結(jié)果的干擾。

倒置熒光顯微鏡MF52-N采用無限遠(yuǎn)光學(xué)設(shè)計和數(shù)顯LED熒光模塊，光路經(jīng)過深度優(yōu)化，能提供簡單易用的熒光激發(fā)和高質(zhì)量的相襯、熒光和明場成像，可選雙光路、一體供電、人走燈滅，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。

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