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  jxsrzhb521 2016-12-01 18:05:41

  樣品制備： 變性條件——SDS LB直接裂解： 用常溫或者高溫預(yù)熱過（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會(huì)改變）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。通常6孔板細(xì)胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDSLB都是過量的（因此不一定要嚴(yán)格參考SDS LB稀釋比）；如果SDSLB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時(shí)，煮樣后會(huì)發(fā)現(xiàn)tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時(shí)候常規(guī)做法有兩種，1.再煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5min，樣品過濃時(shí)就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當(dāng)增加SDSLB，繼續(xù)煮；也可以對(duì)樣品進(jìn)行超聲。煮樣時(shí)間若過長，蛋白會(huì)凝固，此時(shí)以失去繼續(xù)WB的意義，請(qǐng)丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層） 此方法的缺點(diǎn)，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。 非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實(shí)類似） 裂解細(xì)胞請(qǐng)盡量冰上操作，減緩酶解作用。 俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl， pH7.6， 100mM NaCl， 20mM KCl，1.5mM MgCl2， 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin，10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶YZ劑很復(fù)雜也很貴，其實(shí)用0.5mMPMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF， 1 mM Na3VO4， 50 mMbeta-GP。 此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗(yàn)。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時(shí)染色體會(huì)析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗(yàn)，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強(qiáng)的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細(xì)胞。 用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%，但此時(shí)染色體會(huì)析出，沉淀粘稠。 組織塊裂解： 組織塊較大用勻漿的方法Z合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。 當(dāng)組織超微量的時(shí)候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是 1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。 2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復(fù)多次。 3. 用上述細(xì)胞裂解液回收。 分泌型蛋白富集： 用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集上清液用于WB檢測(cè)；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集。 “乘機(jī)安全小貼士”安全出行要重視 理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時(shí)對(duì)細(xì)胞生長條件的影響Z小，是Z佳的實(shí)驗(yàn)條件；但是這存在隱憂。因?yàn)楹宓呐囵B(yǎng)基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會(huì)有非常大的麻煩，尤其當(dāng)你的蛋白在60-46kDa之間的時(shí)候；用“任何”抗體去檢測(cè)這一區(qū)間的蛋白，會(huì)有一片非常強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)榇藚^(qū)間蛋白（主要是BSA）濃度過于富集，會(huì)非特異性粘附“任意”抗體，從而Z終被識(shí)別。同理，采用SDS LB裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng)基中的BSA。 采用無血清培養(yǎng)基收集細(xì)胞上清除了改變細(xì)胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號(hào)途徑，諸如AKT等），還會(huì)出現(xiàn)的問題是： 1. 即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對(duì)好很多。 2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。 a. TCA沉淀對(duì)半定量操作要求非常高，因?yàn)楹苋菀壮恋聿怀浞只蛘唠x心操作丟失，尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。 b。重新溶解時(shí)，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對(duì)麻煩。 實(shí)際上，如果你不是非常強(qiáng)調(diào)蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測(cè)上清，尤其半定量的WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同樣品間的差異。這里面有實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)的麻煩——經(jīng)驗(yàn)之談，我曾經(jīng)參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的數(shù)據(jù)是celllysis；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進(jìn)一步分析做準(zhǔn)備。 樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDSLB煮沸過的樣品凍融會(huì)存在另一個(gè)問題，SDS沉淀；SDS 4度就會(huì)沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDSLB不夠，樣品未充分溶解也會(huì)出現(xiàn)類似拖尾；上樣過大也會(huì)）。 在樣品制備過程中，另一個(gè)需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計(jì)。細(xì)胞樣品可以先計(jì)數(shù)再接種，短時(shí)間內(nèi)即使細(xì)胞生長有差異也不會(huì)對(duì)WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大小（稱重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。有人會(huì)說可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白定量的不科學(xué)性，以及裂解液成分對(duì)定量的干擾。 蛋白電泳： 電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請(qǐng)參考分子克隆。經(jīng)驗(yàn)之談，8%膠Z底邊約36KDa，10%Z底邊約25KDa，12%Z底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的的影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的影響都問題不大（300KDa蛋白如何，沒有嘗試過）。 電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器Z高限壓；此條件適合gibco modelV16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點(diǎn)，保證Z快速度完成電泳（電壓會(huì)逐漸增大），省時(shí)且減少擴(kuò)散；但是由于電泳速度過快時(shí)會(huì)發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。

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