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  南宮三九 2013-08-14 00:00:00

  是需要儀器使用維護(hù)方面的培訓(xùn)還是分析方法原理方面的培訓(xùn)？

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  歐陽靜射手 2013-08-14 00:00:00

  【摘要】 目的提高雷公藤片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，摸索GX液相色譜（HPLC）法測定雷公藤片含量的方法。 方法采用GX液相色譜法，C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水（40∶60），檢測波長218 nm。結(jié)果雷公藤甲素線性范圍為0.047 6～0.476 0 μg，r=0.9991，平均回收率為101.2%， RSD為2.1%（n=6）。結(jié)論 雷公藤片含量測定限度暫定為：每片含雷公藤以雷公藤甲素（C37H22O14）計(jì)，不得少于0.01 mg/片。 【關(guān)鍵詞】 雷公藤片 雷公藤甲素 GX液相色譜　　雷公藤片為衛(wèi)矛科木質(zhì)藤本植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f，藥材經(jīng)醋酸乙酯提取后制成的片劑，原衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)采用薄層掃描法［1］測定雷公藤片中雷公藤甲素的含量，因雷公藤藥材中成分較為復(fù)雜，采用薄層法難以得到較好的分離效果，且其展開顯色后極不穩(wěn)定，顯色劑褪色較快，難以得到較好的測定結(jié)果。為了有效地控制其質(zhì)量，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)行動(dòng)計(jì)劃組下達(dá)了提高雷公藤片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的任務(wù)。通過實(shí)驗(yàn)研究，本文建立了HPLC法測定雷公藤片中雷公藤甲素的含量，經(jīng)研究其中雷公藤甲素在所選用條件下分離較好，檢測靈敏度高，測定專屬性強(qiáng)，可以作為本品的含量測定控制方法。　　1 儀器與試藥 　　HP-1100型GX液相色譜儀（Ajilent公司，美國）；大連依利特Hypersil C18液相色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；雷公藤甲素對(duì)照品（ZG藥品生物制品檢定所，批號(hào)0857-9601）；甲醇為色譜純，水為重蒸水；其他試劑為分析純；雷公藤片由湖北三九黃石藥業(yè)有限公司提供。　　2 方法與結(jié)果　　2.1 色譜條件 　　色譜柱為大連依利特Hypersil C18液相色譜柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；甲醇-水（40∶60）為流動(dòng)相；檢測波長218 nm；流速1 ml/min；柱溫：35℃；理論板數(shù)按雷公藤甲素峰計(jì)不低于3 000?！　?.2 供試液制備方法和洗脫液用量的選擇　　2.2.1 供試液制備方法的選擇 　　雷公藤制劑中成分較為復(fù)雜，不經(jīng)提取精制難以得到較好的分離效果，參照常雪靈等［2］的文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行了提取精制方法的考察。精密稱取樣品粉末約1 g，加醋酸乙酯20 ml，超聲使溶解，加5%HCl溶液15 ml洗滌兩次，棄去酸液，醋酸乙酯液加10%NaOH溶液20 ml，水浴加熱15 min，分取堿液，并用10%NaOH溶液20 ml萃取兩次，合并堿液，加稀HCl調(diào)pH至4，以醋酸乙酯20 ml萃取3次，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓ㄈ葜?0 ml作為供試品溶液。 精密稱取樣品粉末約1 g，加氯仿10 ml，超聲10 min，加中性氧化鋁1 g，攪拌均勻，蒸干，上中性氧化鋁柱（內(nèi)徑12 mm，100～200目，10 g），以醋酸乙酯溶液洗脫，收集洗脫液150 ml，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓ㄈ葜?0 ml作為供試品溶液。 精密稱取樣品粉末約1 g，加氯仿10 ml，超聲10 min，加中性氧化鋁1g，攪拌均勻，蒸干，上中性氧化鋁柱（內(nèi)徑12 mm，100～200目，10 g），以10%醋酸乙酯石油醚（60～90℃）50 ml 洗脫，再以1%乙醇醋酸乙酯溶液洗脫，收集洗脫液100 ml，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓ㄈ葜?0 ml作為供試品溶液。 取上述3種溶液按擬定的色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果見表1。表1 3種提取分離方法測定結(jié)果（略） 結(jié)果表明：采用上中性氧化鋁柱提取分離效果較萃取法好，方法3中用10%醋酸乙酯石油醚（60～90℃）50 ml 洗脫主要是除去雜質(zhì)，但經(jīng)比較此法對(duì)分離影響不大，而以1%乙醇醋酸乙酯溶液洗脫對(duì)測定結(jié)果無多大影響，但洗下較多雜質(zhì)，基線波動(dòng)較大，雜質(zhì)峰較多，對(duì)分離造成一定影響，故采用方法2作為含量測定方法?！　?.2.2 溶劑用量的選擇精密稱取樣品粉末約1 g，共3份，分別加氯仿10 ml，超聲10 min，加中性氧化鋁1 g，攪拌均勻，蒸干，上中性氧化鋁柱（內(nèi)徑12 mm，100～200目，10 g），以醋酸乙酯溶液洗脫，分別收集洗脫液100 ，150 ，200 ml，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，定容?0 ml作為供試品溶液。 將3種溶液按擬定的色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果見表2。表2 3種溶劑用量測定結(jié)果（略） 結(jié)果表明，以醋酸乙酯溶液洗脫，收集洗脫液150 ml較合適。　　2.2.3 流動(dòng)相的選擇以乙腈-水（30∶70）作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果雷公藤甲素出峰較快，樣品溶液難以得到較好分離，改用（15∶85），（20∶80），（25∶75）等雷公藤甲素均不出峰，Z后選用甲醇-水（40∶60）為流動(dòng)相，雷公藤甲素出峰時(shí)間約為11 min，樣品溶液分離較好，無雜質(zhì)峰干擾。 　　2.3 含量測定　　2.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含0.01 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液?！　?.3.2 供試品溶液的制備 　　取本品30片，稱定重量，研碎，精密稱取10片量，加氯仿10 ml，超聲10 min，加中性氧化鋁1g，攪拌均勻，蒸干，上中性氧化鋁柱（內(nèi)徑12 mm，100～200目，10 g），以醋酸乙酯溶液洗脫，收集洗脫液150 ml，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，定容?0 ml作為供試品溶液。　　2.3.3 線性關(guān)系考察精密稱取雷公藤甲素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含0.0238 mg的溶液作為對(duì)照品貯備液。 精密吸取對(duì)照品貯備液1，2，4，6，8，10 ml，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μl，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，雷公藤甲素對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=2 110.8X+3.7，r=0.999 1，結(jié)果表明雷公藤甲素對(duì)照品在0.047 6～0.476 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。　　2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 　　精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定雷公藤甲素的吸收峰面積，RSD為1.84%，表明精密度良好?！　?.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 　　精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)040311），分別間隔2h進(jìn)行測定，以雷公藤甲素的吸收峰面積進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，測得RSD為2.39%，表明樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定?！　?.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 　　分別精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)040311）樣品粉末5份，每份約1 g，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，結(jié)果樣品中雷公藤甲素的平均含量為11.48 μg/g，RSD為1.36%，表明本法重復(fù)性良好?！　?.3.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 　　精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)040311）6份，分別精密加入雷公藤甲素對(duì)照品溶液（0.050 48mg/ml）1 ml，加入氯仿10 ml，按供試品溶液制備方法制備，依法測定。6次平均回收率為101.2%，RSD為2.1%。結(jié)果見表3。表3 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）　　2.3.8 樣品含量測定取本品30片，稱定重量，研碎，精密稱取10片量，按供試品溶液制備方法制備。精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各20 μl，依法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。雷公藤甲素和雷公藤片樣品的GX液相色譜圖見圖1～2。表4 樣品含量測定結(jié)果（略）　　3 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC法可以取代原標(biāo)準(zhǔn)中用薄層掃描法測定雷公藤片中雷公藤甲素的含量。4批樣品雷公藤甲素含量均在0.01 mg/片之上，但考慮到雷公藤片片重差異，本品含量限度可暫定為：每片含雷公藤以雷公藤甲素（C37H22O14）計(jì)，不得少于0.01 mg/片。 【參考文獻(xiàn)】 　?。?］中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑，第16冊(cè)［M］.1993：113. 　?。?］常雪靈，陳華兵，徐輝碧，等.反相GX液相色譜測定雷公藤浸膏甲素的含量［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19（4）：327.

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  wangbiaocooec 2013-08-14 00:00:00

  本次培訓(xùn)主要講解了以下六個(gè)方面的內(nèi)容:一、GX液相色譜法原理與方法發(fā)展二、GX液相色譜儀的原理、結(jié)構(gòu)、使用和維護(hù)三、樣品制備四、色譜柱的原理、選擇及維護(hù)五、GX液相色譜數(shù)據(jù)處理及定性與定量分析六、GX液相色譜儀在各領(lǐng)域的應(yīng)用由于GX液相色譜適于分析沸點(diǎn)高、相對(duì)分子量大，受熱易分解的不穩(wěn)定的有機(jī)化合物、生物活性物質(zhì)以及多種天然產(chǎn)物，而這些化合物約占所有有機(jī)化合物的80%，因此，GX液相色譜儀具有廣泛的使用范圍，對(duì)于有機(jī)監(jiān)測工作也就非常重要。而GX液相色譜儀的維護(hù)又決定了工作效率，因此為了能更好的更快速的完成監(jiān)測工作，必須要懂得維護(hù)儀器，當(dāng)然也必要的學(xué)習(xí)儀器的一些基本維修技術(shù)。對(duì)于經(jīng)常遇到的堵塞問題是由于磷酸鹽緩沖液在管路中沉積導(dǎo)致，解決辦法就是每次做完實(shí)驗(yàn)先經(jīng)純水再經(jīng)甲醇沖洗。色譜柱是GX液相色譜儀的核心部分，它的好壞直接影響到樣品分離度的好壞，為了延長HPLC液相泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須注意以下幾方面的事項(xiàng)：1、防止任何固體微粒進(jìn)入HPLC液相泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)都會(huì)磨損HPLC液相柱塞、HPLC密封環(huán)、HPLC液相缸體和HPLC液相單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相Z好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是過濾，可采用Millipore 濾膜（0.2um 或 05um） 等濾器。2、流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是HPLC停泵過夜或更長時(shí)間的情況下。如果將含有緩沖液的流動(dòng)相留在HPLC液相泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜止，就可能析出鹽的微小晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞HPLC密封環(huán)和HPLC柱塞等。因此，必須HPLC泵入純水充分清洗后，再換成適合于HPLC色譜柱保存和有利于HPLC泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合固定相，可以是甲醇或甲醇和水）。 3、HPLC泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相用完，否則HPLC空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也磨損HPLC柱塞、HPLC密封環(huán)或HPLC缸體Z終產(chǎn)生漏液。4、HPLC輸液泵的工作壓力不要超過規(guī)定的Z高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。5、流動(dòng)相應(yīng)先脫氣，以免在HPLC泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡HPLC泵就無法工作。而一些常見故障的原因和解決辦法也是得掌握的：1、沒有流動(dòng)相流出，又無壓力指示。原因可能是HPLC泵內(nèi)有大量的氣體，這時(shí)可打開泄壓閥，使HPLC泵在較大的流量（5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個(gè)50ml的注射器在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)原因可能是HPLC密封環(huán)磨損，需更換。2、HPLC壓力的流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除，或者是單向閥內(nèi)有異物，可以卸下HPLC單向閥，浸入丙酮內(nèi)，進(jìn)行超聲清洗。有時(shí)有可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡或被鹽的微小晶體?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時(shí)卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)，超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒（片）浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。3、HPLC壓力過高的原因，是管路被堵塞，需要清除或清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)可逐段進(jìn)行。在管路中存在氣泡會(huì)造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降；氣泡變大進(jìn)入流路或色譜柱時(shí)會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或不穩(wěn)定，使基線起伏。因此流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，在注入樣品前也應(yīng)注意排出樣品注射器中的空氣。本次培訓(xùn)還指導(dǎo)了色譜柱的選擇，只有選擇合適的色譜柱才能取得很好的色譜峰，也就能很好的定性及定量分析。如果色譜柱經(jīng)過一段時(shí)間的使用后有凹陷的情況，也可以自行填補(bǔ)，即打開柱頭，以相同或者相似的填料將凹陷的部分填平。對(duì)嚴(yán)重污染的柱子可以掉頭使用，但必須將連接檢測器的一端斷開，將污染物質(zhì)沖走，若基線還是有雜峰，也可以進(jìn)行挖補(bǔ)，往往可基本恢復(fù)。

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