HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：為什么要控制PH值？

適用于HPLC和LC/MS的緩沖液

如果樣品中含有離子化化合物，對于反相HPLC（RP-HPLC）分離，流動相pH值可作為控制保留的Z重要的變量之一。

然而，如果控制不當(dāng)，pH值也可能誘發(fā)諸多問題。

由于經(jīng)RP-HPLC分析的大多數(shù)化合物含有一個或多個酸性或堿性官能團(tuán)，因此大多數(shù)流動相需要控制pH值。

基于此，緩沖液的使用非常廣泛。本手冊為實(shí)際操作的色譜分析人員ZD介紹了流動相pH值的一些重要方面。

為什么要控制PH值？

圖1表明，如果存在離子化化合物，則需要控制pH值。

如果酸性溶劑pKa上下浮動超過2個pH單位，則至少99％的部分將分別離子化或非離子化。

低于其pKa時，堿基將被離子化；而超過其pKa時，將被非離子化。

非離子化形式將具有較小的極性（更疏水），因此在反相體系中能夠更加有效地保留下來。

所以，pH值較低時，會保留更多的酸性（圖1a），而在高pH值下，會保留更多的堿性（圖1b）。

如果流動相pH值接近pKa值，那么即便pH的變化極為微小，也會導(dǎo)致保留情況的巨大變化，因此，這不適合穩(wěn)定分離。

圖2a說明了部分化合物對pH的微小變化極為敏感。0.1個pH單位的變化就會導(dǎo)致分辨率兩倍的變化，這是許多實(shí)驗(yàn)室常見的pH調(diào)節(jié)誤差量。

圖2b顯示了酸性、堿性和中性化合物pH值與保留情況的關(guān)系。

pH為3時，其保留情況比pH為5時更加敏感（對于酸性），而對于堿性，則pH需要大于等于6。而且，當(dāng)pH接近pKa時，保留時間將不穩(wěn)定；如果存在類似結(jié)構(gòu)的化合物，相應(yīng)的峰值間距（選擇性）會發(fā)生改變。

圖2 流動相pH值的微小變化對分離的影響。

（a）堿性分析物：對氨基苯甲醚、間甲苯胺、對氯苯胺、間氨基苯甲腈（按保留次序）；27:73甲醇/磷酸鹽緩沖液。
（b）酸性（酸）：水楊酸；堿；甲基笨丙胺；中性；非那西丁。

在選擇流動相pH時還應(yīng)考慮的另一個因素是色譜柱的穩(wěn)定性。

一般來說，硅基色譜柱應(yīng)在2<pH<8的條件下操作。在pH<2時，由于可能發(fā)生水解而導(dǎo)致鍵合相的損失。

pH大于8時，硅膠骨架可溶性變強(qiáng)。較高純度的硅膠比較低純度的產(chǎn)品更耐受較高的pH值。

另一個較為復(fù)雜的問題是，硅膠顆粒表面上可能會電離出未鍵合的硅醇（-Si-OH）基團(tuán)。
對于較老的、純度低的硅膠（通常稱為“A型”硅膠），這些硅醇基團(tuán)的pKa在pH4-5的范圍內(nèi)。也就是說，在pH>6時，這些材料會發(fā)生顯著的硅烷醇電離。

為什么要控制PH值？

一直以來這都是通過陽離子交換過程使堿性化合物達(dá)到峰拖尾的主要原因。

較新的高純度（“B型”）硅膠的pKa>7，因此由離子化硅烷醇位點(diǎn)的陽離子交換引起的峰拖尾是Z小的。

因此，高純度硅膠比較老的硅膠的峰形更好，正如圖3所示分離中的幾種堿基成分那樣。

除了峰形得到改善之外，由于這些不可預(yù)測的次級硅烷醇相互作用的減少，高純度硅膠比低純度硅膠具有更好的再現(xiàn)性。

圖3. 高純度硅膠在減少堿基硅烷醇拖尾的效果。
成分：去甲瑪黃堿、去甲替林、甲苯（中性）、丙咪嗪、阿米替林。
條件：250 x 4.6 mm, 5μm

色譜柱；80:20甲醇/25 mM 磷酸鹽(pH 6.0)；1.00mL/min

為什么要控制PH值？未完.....待續(xù)