介紹

超分辨率顯微成像是一系列能夠使研究人員能夠“打破”光學(xué)顯微鏡衍射障礙的方法，在該系列方法中分辨率Z高的技術(shù)為光激活定位顯微技術(shù)（PALM）。這些方法依賴于在數(shù)千幀中對單個分子的隨機子集進行定位（SMLM），并將這些個體的定位重構(gòu)為單個超分辨率圖像。傳統(tǒng)的定位顯微鏡可以在橫向維度上進行10~20nm的精確成像，為了實現(xiàn)更高的定位精度，要求顯微鏡配置具有更高信噪比的靈敏探測器。盡管橫向分辨率令人印象深刻，但傳統(tǒng)的2D SMLM仍通常缺乏軸向分辨率。

美國Double Helix Optics公司的SPINDLER系列3D顯微鏡成像模塊與3DTRAXR軟件相結(jié)合，可在三維尺度上實現(xiàn)高精度、亞衍射極限定位，并具有擴展的深度成像能力。SPINDLE采用精密光學(xué)器件設(shè)計，可與市面上在售的科學(xué)顯微鏡無縫集成，并提供前所未有的橫向和軸向精密成像組合。用戶可根據(jù)具體的應(yīng)用選擇合適的相位掩模版以實現(xiàn)基于深度范圍、發(fā)射波長和信噪比等參數(shù)對點擴散函數(shù)（PSF）的優(yōu)化，更重要的是，SPINDLE可在無需掃描的情況下在單張圖像中將傳統(tǒng)成像系統(tǒng)的景深擴大10倍。

在本文中，我們展示了如何將SPINDLE成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡結(jié)合使用以在所有三個維度（x、y、z）上實現(xiàn)亞衍射極限成像。SPINDLE可與任何高質(zhì)量的科學(xué)相機兼容，無論是emccd還是scmos都可以提供定位顯微鏡所需的高信噪比圖像。

使用SPINDLE和DH-PSF相位掩模版對細(xì)胞微管進行三維超分辨成像

在本文中，我們證明了使用SPINDLE單通道模塊可以實現(xiàn)高精度、大深度的超分辨率重建。如圖1所示，使用Double Helix (DH-PSF) 的相位掩模版與SPINDLE單分子定位顯微鏡組件結(jié)合。系統(tǒng)將單個分子發(fā)出的光分成兩個光瓣，通過找到兩個光瓣的中心來檢索發(fā)光點的橫向（x-y）位置；兩光瓣之間的角度編碼了發(fā)光點的軸向（z）位置。這些額外的信息將有助于在橫向和軸向尺寸上以非常高的精度（<20nm）進行超分辨率重建。此外，SPINDLE擴展了分子可以定位的景深，這種精確度和擴展深度成像的結(jié)合能夠以顯著提高的z軸分辨率以收集更多的數(shù)據(jù)。

圖1：基于單分子定位顯微成像技術(shù)（SMLM）技術(shù)的帶有可互換相位掩模支架的SPINDLE模塊

為了演示SPINDLE的工作原理，我們使用NikonN-STORM顯微鏡結(jié)合Photometrics Prime 95B相機對被AlexaFluor 647偶聯(lián)微管蛋白抗體標(biāo)記的Cos7細(xì)胞進行了成像。對于該樣品，我們使用經(jīng)過優(yōu)化的相位掩模版，該掩模版可與遠(yuǎn)紅外波長染料和1.49 NA的100倍物鏡配合使用。樣品在640 nm激光連續(xù)照射下在Prime95B上成像，曝光時間為30 ms。使用3DTRAX軟件對單發(fā)射點進行定位，并將結(jié)果導(dǎo)出到ImageJ插件Thun-der STORM。使用歸一化高斯方法重建圖像，并使用ImageJ查找表“Spectrum”以顏色對z深度進行編碼。

圖2：單個100nm珠在Prime95B上使用SPINDLE在焦平面（0μm）和焦平面上方（+1μm）和下方（-1μm）微米處的成像圖

重建的結(jié)果包含超過200萬個定位，并顯示Cos7細(xì)胞中微管的30μmx30μm視野、深度超過2.1μm的范圍（圖3左）。深度以顏色編碼，細(xì)胞底部為紅色/紫色，頂部附近為黃色/橙色。放大的插圖顯示微管在一定深度范圍內(nèi)得到了很好的重建（圖3，右）。這些數(shù)據(jù)突出了使用Double Helix SPINDLE模塊帶來的擴展景深成像和高橫向和軸向分辨率。

使用Double Helix 3DTRAX軟件進行高精度三維定位

Double Helix 3DTRAX軟件是一個ImageJ/FIJI插件，其可以在橫向和軸向以亞衍射極限精度定位單個分子。3DTRAX還使用克拉美-拉奧下限(CRLB)5計算了每個定位分子的精度值。該計算基于每個定位的信噪比。

圖3：使用SPINDLE(R)和Prime 95B成像的微管三維超分辨率重建圖。左圖：Cos7細(xì)胞免疫染色的微管蛋白，顏色編碼深度。右圖：左側(cè)圖像的放大區(qū)域，顯示了深度超過2微米的微管。圖片由Double Helix Optics提供。平均CRLB值橫向約10nm，軸向約20nm（圖3）

概括

Double Helix的SPINDLE超分辨率3D顯微成像模組、相位掩模和3DTRAX軟件的組合可實現(xiàn)高精度大深度三維成像、跟蹤和計數(shù)。在此應(yīng)用中，我們在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的三維超分辨率重建中展示了大約10nm的橫向精度和20nm的軸向精度。SPINDLE系列產(chǎn)品為研究人員提供了強大的工具集，可促進對廣泛生物系統(tǒng)中分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)相互作用的理解。

圖4：橫向和軸向精度。用于重建圖2所示圖像的定位精度值。精度值由3DTRAX軟件根據(jù)其信噪比使用每個發(fā)射器的Cramer-Rao下界5計算得出。定位數(shù)顯示在y軸上，精度值(nm)顯示在x軸上

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關(guān)于Double Helix Optics

美國Double Helix Optics是一家位于美國科羅拉多州博爾德的計算光學(xué)公司。Double Helix Optics采用其專 利的雙螺旋光工程成像技術(shù)設(shè)計開發(fā)下一代高精度3D成像產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域以實現(xiàn)對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)3D的成像、跟蹤和計數(shù)。

Double Helix的SPINDLE系列成像模塊與可切換的相位掩模庫以及用于計算重建和分析的軟件相結(jié)合，確保為我們的客戶及其應(yīng)用的具體情況提供Z 高質(zhì)量的3D成像技術(shù)。

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