Xevo MRT新型多反射高分辨質(zhì)譜儀以其杰出的整體性能提供更高的質(zhì)量分辨率（100,000 FWHM）、更準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)（<500 ppb）、更快的采集速率（100 Hz），非常適合代謝組學(xué)研究領(lǐng)域。 本實(shí)驗(yàn)使用Xevo MRT進(jìn)行人糞便樣本代謝組學(xué)分析，使用數(shù)據(jù)依賴型采集模式（DDA）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，其結(jié)果顯示，該儀器能夠提供出色的質(zhì)譜分辨率，長(zhǎng)期的系統(tǒng)穩(wěn)定性；同時(shí)其高靈敏度、采集速度和質(zhì)量精度，保證了MS/MS覆蓋率和化合物鑒定數(shù)量。
圖1. Xevo MRT MS外觀及結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2. 糞便樣本代謝組學(xué)分析工作流程。
樣品前處理
取糞便樣品50 mg，加入500 μL預(yù)冷的80%乙腈，振蕩15 min；12,000 rpm，4 ?C下離心10 min；取上清液進(jìn)行濃縮，使用100 μL純甲醇復(fù)溶后，放入進(jìn)樣瓶中用于LC-MS分析。
質(zhì)控混樣：取待研究的每個(gè)生物樣品的少量等分試樣，將它們充分混合，然后定期進(jìn)樣。
實(shí)驗(yàn)條件
液相色譜條件
液相系統(tǒng)：
ACQUITYTM Premier UPLC System
色譜柱：
ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1x 100 mm, 1.8 μm)
流動(dòng)相A：
0.1% 甲酸水
流動(dòng)相B：
0.1% 甲酸乙腈
柱溫：
40 ℃
樣品室溫度：
10 ℃
進(jìn)樣量：
1 μL
梯度：
詳見(jiàn)下圖
質(zhì)譜條件
質(zhì)譜系統(tǒng)：
Xevo MRT MS
采集模式：
DDA, Top 15
離子化模式：
ESI+
離子源溫度：
120 ℃
脫溶劑氣溫度：
550 ℃
毛細(xì)管電壓：
1.0 kV
錐口電壓：
20 V
錐口氣流速：
100 L/hour
脫溶劑氣流速：
1,000 L/hour
數(shù)據(jù)處理軟件
使用waters_connectTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，在waters_connect的MS Toolkit應(yīng)用程序中將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，并通過(guò)MARS組學(xué)軟件（Mass-Analytica）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB）進(jìn)行化合物鑒定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
①
樣品基峰色譜圖（BPI）圖展示,見(jiàn)圖3：為單針人糞便樣本對(duì)應(yīng)的BPI圖，色譜分離度良好。
圖3. 人糞便樣本BPI圖。
②
Xevo MRT MS的高靈敏度和采集速度，可以提供足夠多高質(zhì)量的MS/MS譜圖，用于后續(xù)的鑒定；如下圖所示，樣品在約0.01 min的時(shí)間窗口內(nèi)（5.621-5.630 min, 6.639-6.650 min）可以采集到10張MS/MS譜圖，單針30 min的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，可以采集到20,000+的MS/MS譜圖。
圖4.樣品MS/MS譜圖展示。
③
質(zhì)控混樣疊加圖展示，見(jiàn)圖5：樣品，空白及質(zhì)控混樣共200針，每針30 min檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，連續(xù)跑樣100小時(shí)，其中每隔15針插入一針混樣用于質(zhì)控，如下所示，所有混樣譜圖疊加良好，表明儀器具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和抗污染能力，適用于大隊(duì)列組學(xué)研究。
圖5.質(zhì)控混樣疊加圖。
④
使用MARS組學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，共提取到72,970個(gè)特征離子，其中39,841個(gè)特征離子得到MS/MS，MS/MS覆蓋率達(dá)到50%以上。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾（MS/MS過(guò)濾，QC過(guò)濾，空白過(guò)濾，RT過(guò)濾等），最終可得到6,077個(gè)特征離子，然后使用HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定（包含217,753個(gè)化合物，50,412張MS/MS譜圖），最終有3,380個(gè)化合物可得到鑒定結(jié)果。其中以離子m/z 176.0707@5.65 min為例，鑒定結(jié)果為吲哚乙酸，它常被視為腸道菌群代謝活性的特征代謝物之一，其質(zhì)量偏差為500 ppb。
圖6.MARS組學(xué)軟件峰提取結(jié)果。
圖7.使用HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)搜索后得到的鑒定結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)采用ACQUITY Premier UPLC-Xevo MRT進(jìn)行DDA模式采集，結(jié)合代謝組學(xué)軟件對(duì)人糞便樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析：
01
Xevo MRT MS采用多反射超高分辨率飛行時(shí)間（MRT）技術(shù)可在較寬的m/z范圍內(nèi)提供始終如一的質(zhì)譜分辨率。
02
創(chuàng)新的采集系統(tǒng)配備雙增益模數(shù)轉(zhuǎn)換器，使其在高動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)亦可保持長(zhǎng)期的系統(tǒng)穩(wěn)定性：樣品、空白及混樣共200針，每針30min檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，連續(xù)跑樣100小時(shí)，其中每隔15針插入一針混樣用于質(zhì)控，質(zhì)控混樣譜圖疊加良好。
03
Xevo MRT MS的高靈敏度、采集速度和質(zhì)量精度，保證了MS/MS覆蓋率和化合物鑒定數(shù)量：?jiǎn)吾?0 min的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，可以采集到20,000+MS/MS譜圖；所有樣品共提取到72,970個(gè)特征離子，其中39,841個(gè)特征離子得到MS/MS，MS/MS覆蓋率達(dá)到50%以上；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，可得到6,077個(gè)化合物，使用HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)，最終有3,380個(gè)化合物可得到鑒定結(jié)果。
參考文獻(xiàn)
[1] MARS: A Multipurpose Software for Untargeted LC–MS-Based Metabolomics and Exposomics.”Analytical Chemistry 96.4(2024):1468-1477
[2] Goracci, Laura , et al. “Lipostar, a Comprehensive Platform-Neutral Cheminformatics Tool for Lipidomics.” Analytical Chemistry (2017):acs.analchem.7b01259.
[3] Gall, Le , et al. “Metabolomics of fecal extracts detects altered metabolic activity of gut microbiota in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome.”.
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