微流體學(xué)的Z終目標(biāo)是實現(xiàn)所謂的芯片實驗室，即將通常在實驗室中進(jìn)行的所有實驗活動都整合到一個微流體芯片上操作。在過去的幾年中，微流控朝著這個方向邁出了巨大的步伐：微流控設(shè)備廣泛的應(yīng)用于從物理到生物醫(yī)學(xué)的許多應(yīng)用領(lǐng)域。此外，單個微流控芯片上植入多種功能不僅在便攜性和成本上具有明顯的優(yōu)勢，而且小型化還可以研究細(xì)胞量級的生化現(xiàn)象。

微流控的這些優(yōu)良的特性激發(fā)了研究人員對微流控技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)研究中的廣泛興趣。實際上，使用微流控芯片既可以培養(yǎng)樣品，又可以在同一平臺上進(jìn)行所需要的實驗觀察。然而，微流控芯片中的細(xì)胞培養(yǎng)具有很大的挑戰(zhàn)性。實際上，細(xì)胞培養(yǎng)Z重要的問題之一是通過微流控芯片將細(xì)胞從外部撕裂，從而無法直接監(jiān)視其微環(huán)境。在這方面，探測培養(yǎng)室內(nèi)部Z重要的參數(shù)之一是pH值。實際上，細(xì)胞會影響其周圍環(huán)境，例如在呼吸過程中會產(chǎn)生二氧化碳和/或乳酸，從而酸化培養(yǎng)室的微環(huán)境。由于典型的微流控培養(yǎng)室中所含的液體量極低（約1μL左右），因此，這些自然過程的影響會變得更加重要。

因此，能夠動態(tài)地測量甚至是控制微流體裝置內(nèi)的pH值是微流體應(yīng)用的關(guān)鍵主題。在以下部分中，將會簡要介紹微流體器件中實現(xiàn)pH監(jiān)控的幾種方法。此外，補(bǔ)充說明中，還介紹了集成在微流體器件中的用于pH測量的固態(tài)傳感器的基本原理。

微流控中的光學(xué)pH監(jiān)控
當(dāng)前大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都包含簡單的pH指示劑例如酚紅，這些化合物分子的特征在于其能夠根據(jù)周圍環(huán)境的pH值改變顏色。因此，該特性允許進(jìn)行簡單但粗略地監(jiān)測中等pH值。然而，為了能夠通過光學(xué)方法進(jìn)行pH的定量測量，需要具有相當(dāng)長的吸收光的路徑，這對于微流體器件而言顯然是不可能的。

Magnusson等（2013）開發(fā)了一種技術(shù)，該技術(shù)可以克服光吸收路徑長的問題，在成像區(qū)域中實現(xiàn)非吸收性部件，從而可以進(jìn)行定量和極ng確的pH測量。該技術(shù)的前提條件是需要在使用非吸收性液體進(jìn)行任何測量之前對光源進(jìn)行嚴(yán)格的校準(zhǔn)。這種技術(shù)的主要優(yōu)點是僅僅需要標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備例如透射光顯微鏡和帶有CCD傳感器的數(shù)碼相機(jī)，這在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)研究實驗室中都可以找到。以下部分介紹了該技術(shù)的基本工作原理。

圖 1

如圖1所示，從微流體器件發(fā)出的光被光學(xué)顯微鏡中的物鏡收集，然后被選定的帶通濾波片綠光，然后通過旋轉(zhuǎn)鏡將光線輸送到相機(jī)的CCD傳感器上。當(dāng)添加吸收介質(zhì)如包含酚紅的溶液時，到達(dá)相機(jī)的光強(qiáng)度將具有以下形式：

其中，λi是酚紅的兩個吸收波長（酸和堿性形式），∝i是相應(yīng)的吸收系數(shù)，ρ是酚紅的濃度，d是微流體器件的厚度。為了確定兩個吸收系數(shù)之間的比率，在不使用酚紅介質(zhì)的情況下執(zhí)行校準(zhǔn)測量，以便忽略對它的依賴性。因此，我們有：

為了避免時間變化，在成像幀中不僅捕獲培養(yǎng)室圖像，還捕獲芯片附近的空白區(qū)域，與校準(zhǔn)測量值相比，該空白區(qū)域不應(yīng)該顯示吸收。因此，該區(qū)域中的相對強(qiáng)度提供了比率即在校準(zhǔn)（t0）和測量（t1）之間的時間內(nèi)光源強(qiáng)度的變化。對兩個酚紅的吸收波長重復(fù)該過程，然后將兩個獲得的值相除，得出：

先前表達(dá)式的自然對數(shù)給出了酚紅的兩個吸收系數(shù)之間的比率。該比率使用以下表達(dá)式給出細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的pH值：

需要注意的是，pH值還取決于其他因素，例如溫度和所用的特定細(xì)胞培養(yǎng)基。采用的設(shè)備是帶有12個培養(yǎng)室和內(nèi)置閥的PDMS微流體芯片，用于沖洗和培養(yǎng)基供應(yīng)，其設(shè)計由Gomez-Sjober等人（2007）開發(fā)。為了捕捉不同波長的圖像，使用了一些寬度為10nm的商業(yè)帶通濾波片（以430nm和560nm為ZX，以匹配酚紅吸收峰）。該系統(tǒng)是自動化的，可以通過MATLAB軟件進(jìn)行操作。

圖 2

圖2給出了使用此技術(shù)進(jìn)行pH測量的可靠性和可重復(fù)性的一些結(jié)果。測量偏差的主要來源是由于沖洗不完全、沖洗不徹底和化學(xué)痕跡而導(dǎo)致的腔室之間的波動。此外，PDMS對苯酚分子的吸收會引起時間上的連續(xù)偏差，該偏差可以通過在pH測量中引入時間函數(shù)偏差來進(jìn)行解決。

總之，通過使用標(biāo)準(zhǔn)生命科學(xué)儀器進(jìn)行簡單的設(shè)置，該方法可提供可靠且極ng確的pH測量值（對于pH≈7-8，Zda靈敏度＜0.005）。此外，它利用了nL量級的少量培養(yǎng)基，因此，與傳統(tǒng)的pH控制方法相比，降低了昂貴的成本。此測量方法的主要缺點是由于腔室的沖洗不徹底以及微流體器件對吸收介質(zhì)的吸收，pH值出現(xiàn)了意想不到的偏差。

使用混合EIS傳感器/微流體器件進(jìn)行pH測量
Lin（2013）等開發(fā)了一種能夠同時監(jiān)測pH和葡萄糖水平的微流體裝置。圖3示意圖顯示了組成芯片的各個層。從底部開始，有一個電解質(zhì)-絕緣體-半導(dǎo)體（EIS）傳感器粘接到帶有內(nèi)置鋁電極的玻璃基板上，以便傳導(dǎo)來自EIS傳感器底部的傳感器信號。然后，將兩個PDMS層用于樣品的流體處理。特別是，一層承載微流體通道，而另一層PDMS則內(nèi)置六個氣動泵，用于流量調(diào)節(jié)和樣品加載。重要的是這些泵也可以充當(dāng)閥門的功能：實際上，自動壓縮空氣流會將PDMS層偏轉(zhuǎn)到通道上，從而調(diào)節(jié)或阻塞下面的樣品流。Z后，在器件的底部，玻璃基板上有一個Ag/AgCl薄膜參比電極，可為pH測量提供參比電位。

圖 3

下面簡要介紹監(jiān)測pH值的工作原理。EIS傳感器的平帶電壓由以下表達(dá)式定義：

其中，Eref是參考電極電勢，Xsol是溶液的表面偶極電勢，Φsi是硅功函數(shù)，q是電荷，Qss是硅表面每單位面積的表面態(tài)密度，Qox是每單位面積的固定氧化物電荷，Cox是每單位面積的柵極絕緣體電容，ψ是表面電勢。在前面的表達(dá)式中，**的自由參數(shù)是表面電勢，因此，EIS傳感器的平帶電勢的變化僅由表面電勢的變化決定，從而也就是由周圍環(huán)境pH的變化確定。

為了驗證系統(tǒng)的性能，已將四種具有已知pH值（4.03、6.70、7.40和9.57）的溶液注入腔室內(nèi)。

圖 4

圖4是Lin等（2013）人的實驗結(jié)果。所達(dá)到的高線性度（0.9996）表示可以在不同樣品加載之間對腔室進(jìn)行有效沖洗。此外，該系統(tǒng)能夠使用非常少量的試劑（約102μL）進(jìn)行操作。所有測量都是自動進(jìn)行的，從而避免了與手工操作引起的污染有關(guān)的任何問題。

使用基于反饋的微流體系統(tǒng)調(diào)節(jié)pH值
本部分提出了另一種能夠監(jiān)測pH值的微流體器件。該器件由Welch和Christen（2014）開發(fā)，利用PDMS芯片進(jìn)行管理，該芯片可以管理液體以及用于測量pH值的離子選擇場效應(yīng)晶體管（ISFET）。該器件的主要功能是不僅可以進(jìn)行pH探測，還可以自動調(diào)節(jié)液位。實際上，在PDMS芯片（圖5）中，有兩個具有堿性（pH+）和酸性（pH-）溶液的儲液池。這些儲液池的輸出由兩個閥門控制，這兩個閥門調(diào)節(jié)流出的流量以及后面的混合，從而可以主動控制暴露于ISFET傳感器的混合溶液的pH值。

圖 5

如上所述，該器件是通過常規(guī)的PDMS軟光刻技術(shù)加工而成的。聚合物結(jié)構(gòu)位于形成微通道基礎(chǔ)的硅基底上。其向位于pH傳感器所在的反應(yīng)室中的酸和堿性溶液在反應(yīng)室之前在兩個微通道的結(jié)合處混合。第三個無閥輸入通道用于為傳感器校準(zhǔn)目的提供標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液。相同的硅基板支撐著由兩個電極組成的ISFET：一個用于參考，另一個用于感應(yīng)。軟件根據(jù)傳感器的讀數(shù)控制閥門。為了計算輸出信號以管理pH值，使用了比例微分（PD）反饋控制算法。已經(jīng)證明該系統(tǒng)可以實時控制芯片內(nèi)部反應(yīng)室中溶液的pH值。這是通過在0.14pH值的增加和減少方向上進(jìn)行反饋控制的步進(jìn)實現(xiàn)的。Z后，該系統(tǒng)能夠在操作員Z初輸入后的20秒內(nèi)穩(wěn)定達(dá)到pH設(shè)定值。

通過基于水凝膠的微流控芯片主動調(diào)節(jié)pH值
水凝膠是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中越來越重要的一類材料。水凝膠能夠在聚合物鏈之間捕獲水分子的聚合物基質(zhì)。此功能使他們無需任何外部電源即可更改其形態(tài)。此外，此類材料具有高度的生物相容性和耐用性，因此，在文件科學(xué)家的應(yīng)用中非常具有優(yōu)勢。特別地，前述的由環(huán)境參數(shù)的變化觸發(fā)的形狀和尺寸變化的能力可以使它們成為旨在控制pH的良好材料。Atwe等（2014年）利用此功能設(shè)計了一種微流體器件，該器件使用水凝膠作為微閥來根據(jù)其pH值控制流量。pH敏感的水凝膠具有酸性或堿性基團(tuán)，可以通過使它們流過特定pH的介質(zhì)來觸發(fā)電離。這種電離導(dǎo)致抗衡離子從周圍區(qū)域流入凝膠，Z終導(dǎo)致水分子流均衡凝膠邊界兩側(cè)之間的滲透壓。因此，為了維持該壓力梯度，水凝膠根據(jù)pH的變化而發(fā)生膨脹。水凝膠的這種pH依賴性擴(kuò)展是在微流體通道中創(chuàng)建微閥的基本原理。實際上，在Atwe的器件中，水凝膠切片已包含在PDMS芯片內(nèi)部的微通道網(wǎng)絡(luò)中，因此，流路可以根據(jù)流動介質(zhì)的pH值自動變窄或自行擴(kuò)展，從而實現(xiàn)pH值相關(guān)的流量調(diào)節(jié)。

圖 6

圖6顯示了該過程的示意圖：中等pH值會使水凝膠收縮，從而使微通道的直徑從Db減小到Da（Db＜Da）。圖7顯示了在各種pH下，由于離子的吸收，孔尺寸發(fā)生的變化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Zda變化發(fā)生在pH=3時，其中孔從平均直徑20μm穿過到平均值3μm。因此，可以推斷出當(dāng)流動介質(zhì)處于pH=3時，泵的效率Zda。

圖7

補(bǔ)充說明
pH的概念源于Lavoisier和Arrhenius，他們在18世紀(jì)以更科學(xué)的方式研究了這種化學(xué)特性。確實，在他們之前，“酸”和“堿”之間的分類被認(rèn)為是可觀察或感知到的諸如口味之類的特性。Arrhenius首先提出了pH值與給定物質(zhì)中的電荷載體有關(guān)的假設(shè)。特別是，他推斷氫離子在酸性物質(zhì)中攜帶電流，而在堿性物質(zhì)中以離子形式運動。

到目前為止，pH的正式定義為：

其中，公式中的系數(shù)是水合氫離子在摩爾尺度上的活度。此外，在電解質(zhì)溶液中，使?jié)舛忍荻扰c電梯度相關(guān)的公式為Nerst方程：

其中，E是電解質(zhì)的電勢，E^-是標(biāo)準(zhǔn)電勢，R是通用氣體常數(shù)，T是溫度（以開爾文為單位），z是反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)移的電子摩爾數(shù)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，Q_r是反應(yīng)商。該方程式是用于pH測量的固態(tài)傳感器（例如離子選擇場效應(yīng)晶體管（ISFET））實現(xiàn)的基礎(chǔ)（圖8）。實際上，對于這些電位離子傳感器，即其電勢作為離子濃度的函數(shù)進(jìn)行測量的傳感器，Nerst方程規(guī)定電極電勢是該傳感器侵入其中的電解質(zhì)溶液中離子活度的直接對數(shù)函數(shù)。實際上，對于ISFET的平帶電壓，得出的公式為：

其中，除φ_0外，所有項都是常數(shù)。因此，ISFET電勢與表面電勢的直接相關(guān)性使得ISFET對電解質(zhì)pH敏感。ISFET類似于金屬氧化物半導(dǎo)體場效應(yīng)晶體管（MOSFET），實際上可以用相同的等效電路對其進(jìn)行等價（圖9，c）。

圖 8

兩者之間的宏觀差異是MOSFET的金屬柵極（圖9，a）被參比電極的金屬（圖9，b）代替。參比電極只是金屬線和水溶液之間的接觸點，用于確定該溶液的電勢。實際上，參比電極例如由AgCl線（具有不溶性AgCl涂層的銀）在KCl溶液中以恒定濃度組成。根據(jù)能斯特方程式，電化學(xué)耦合的形成產(chǎn)生恒定的電勢。參比電極的內(nèi)部溶液與必須通過勢壘（所謂的熔塊）測量電位的溶液接觸。請注意，對于這種類型的電位傳感器，必須使感測材料（膜）導(dǎo)電，因為測量電路必須“閉合”。換句話說，參比電極以穩(wěn)定的方式將穿透氧化物的電場耦合到“電子世界”。如果氧化物的外表面與與氧化物接觸的離子溶液處于平衡狀態(tài)，則產(chǎn)生的界面電位將調(diào)節(jié)電場，因此，在“離子世界”和“電子世界”之間提供了wan美而穩(wěn)定的接觸。

圖 9

此外，在ISFETS的情況下，柵極電壓是參考電極上的電壓，通常為零（接地參考電極），但是閾值電壓包含在一側(cè)反映液體和柵極氧化物之間界面的項，并且液體和參比電極在另一側(cè)。因此，設(shè)計具有Zda靈敏度和選擇性的pH敏感ISFET需要對氧化物-電解質(zhì)界面進(jìn)行詳細(xì)研究，以便能夠選擇**氧化物，而氧化物并不是MOSFET所用的二氧化硅。

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