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一、柱體積的計(jì)算

我們在一些沖洗方法的資料中，經(jīng)常會看到10倍柱體積或者20倍柱體積的說法。那么柱體積應(yīng)該如何計(jì)算呢？我們可以把色譜柱想象為一個圓柱形，因此可以參考圓柱形計(jì)算公式。

V=πr²L

V=色譜柱體積(mL) ?r=色譜柱半徑(cm) ?L= 色譜柱長度(cm)

常規(guī)250*4.6mm的規(guī)格，柱體積經(jīng)計(jì)算為4.15mL，以1mL/min的流速10倍柱體積就是42min左右。以下是一些常見規(guī)格的柱體積值，可作為參考。

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二、Kromasil反相C18柱的沖洗

反相C18柱是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛的固定相之一，首先我們先從反相C18柱的常見情況沖洗進(jìn)行介紹，分別是：一般污染的沖洗、使用緩沖鹽后的沖洗、生物樣品分析后的沖洗。

1、一般污染的沖洗

一般污染是指的是我們每次分析使用后常見的污染情況，例如試劑和樣品雜質(zhì)對色譜柱產(chǎn)生的污染，或者是一些聚合物的形成等。

① ? 高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗10倍柱體積。這樣可以將殘留在色譜柱中的緩沖鹽和一些極性化合物沖洗干凈；

② ? 高比例的有機(jī)相（例如：80%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗10-20倍柱體積。高比例有機(jī)相可以將一些疏水性的雜質(zhì)沖洗干凈；

③ ? 如果執(zhí)行上述沖洗之后還是污染問題沒有被解決，可以選擇異丙醇沖洗10-20倍柱體積。

2、使用緩沖鹽后的沖洗

流動相中時常會加入一些緩沖鹽，這些緩沖鹽可能會在色譜柱中析出，導(dǎo)致柱壓升高等問題，影響后續(xù)使用。

① ? 開啟柱溫箱，高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗20倍柱體積；

② ? 以未加入緩沖鹽的方法起始比例流動相進(jìn)行平衡。

3、生物樣品污染

生物分析實(shí)驗(yàn)中，通常前處理較為復(fù)雜，導(dǎo)致樣品無法處理干凈。可能會殘留小分子肽等物質(zhì)，其會吸附在色譜柱的管壁或者篩板上，造成柱壓高、峰型差、分離度降低等問題。

① ? 在流動相的有機(jī)相中加入0.1%的三氯乙酸，以增強(qiáng)對吸附蛋白質(zhì)的洗脫；

② ? 如果問題仍未解決，可嘗試在色譜柱里面進(jìn)100uL三氮乙醇，嘗試清洗強(qiáng)保留的蛋白

三、Kromasil色譜柱沖洗指南

關(guān)于其他常見色譜柱的沖洗方法，可按照以下提示進(jìn)行嘗試，若使用其他品牌的色譜柱請和廠商工程師確認(rèn)后進(jìn)行參考。

1、反相柱的沖洗

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

① ? 90%水-乙睛溶液

② ? 100%四氫呋喃

③ ? 95%乙腈-水溶液

④ ? 不含鹽的初始比例流動相

⑤ ? 初始比例流動相平衡

2、正相柱的沖洗-硅膠柱

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

① ? 異丙醇

② ? 甲醇

③ ? 乙酸乙酯

④ ? 流動相

3、正相柱的沖洗-氰基柱、二元醇基柱

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

① ? 三氯甲烷

② ? 異丙醇

③ ? 二氯甲烷

④ ? 流動相

色譜柱污染在日常分析中在所難免，因此可以考慮購買Kromasil保護(hù)柱來進(jìn)行預(yù)防。Kromasil保護(hù)柱采用分析柱相同填料填充，不增加死體積與不改變分離的同時，可以有效保護(hù)分析柱，延長使用壽命。

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