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臨床上，觸診是評(píng)估腫瘤惡性程度的重要診斷方法之一。在實(shí)驗(yàn)室研究中，人們普遍認(rèn)為腫瘤及其周圍組織的整體硬度與腫瘤的惡性狀態(tài)密切相關(guān)。在此，我們假設(shè)除了腫瘤硬度之外，腫瘤的粘彈性——即腫瘤組織在受到壓縮后需要一定時(shí)間才能恢復(fù)原狀這一特性，也可以用于評(píng)估腫瘤的惡性狀態(tài)。在這項(xiàng)工作中，我們使用最近開(kāi)發(fā)的微流控壓縮裝置和理論冪律模型來(lái)表征乳腺腫瘤球體的粘彈性特性。我們使用了不同惡性程度的乳腺腫瘤細(xì)胞：非致瘤性上皮細(xì)胞（MCF10A）、中度惡性腫瘤細(xì)胞（MCF7）和三陰性轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞（MDA-MB-231）。將球體嵌入三維細(xì)胞外基質(zhì)中，對(duì)其進(jìn)行周期性壓縮，并通過(guò)顯微鏡成像記錄其應(yīng)變響應(yīng)。我們的研究結(jié)果表明，所測(cè)得的應(yīng)變松弛曲線能夠通過(guò)一個(gè)修正后的冪律模型成功描述，這證明了非致瘤性腫瘤球體比致瘤性腫瘤球體更具彈性，松弛時(shí)間更短，塑性更小。總之，這些結(jié)果突顯了腫瘤球體的粘彈性特性除了整體硬度之外，還可以作為腫瘤惡性程度的補(bǔ)充機(jī)械生物標(biāo)志物，并證明了修正后的冪律模型在活體組織機(jī)械特性表征中的有效性。

腫瘤力學(xué)已成為腫瘤惡性狀態(tài)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，大量研究表明，組織硬度增加會(huì)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。這種硬度的升高源于腫瘤細(xì)胞的不受控制的增殖以及周圍細(xì)胞外基質(zhì)的硬化。然而，多項(xiàng)研究顯示，在單細(xì)胞水平上，惡性細(xì)胞往往比其非惡性細(xì)胞更軟。我們知道，腫瘤或一般活組織本質(zhì)上是復(fù)雜的且高度適應(yīng)性的，能夠根據(jù)微環(huán)境的變化動(dòng)態(tài)重塑其周圍基質(zhì)的機(jī)械特性。因此，開(kāi)發(fā)策略以在生理現(xiàn)實(shí)的實(shí)驗(yàn)條件下，并在多個(gè)時(shí)間和長(zhǎng)度尺度上研究腫瘤力學(xué)至關(guān)重要。

如今，腫瘤力學(xué)研究主要集中在腫瘤細(xì)胞/組織或周圍細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的整體剛度上。只是最近才發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)的粘彈性而非僅僅剛度在細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤侵襲中發(fā)揮著重要作用。這并不令人意外，因?yàn)槟[瘤侵襲是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。在一項(xiàng)具有里程碑意義的研究中，Chaudhuri 等人 16 強(qiáng)調(diào)了研究活體材料粘彈性的重要性，指出其在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移行為方面起著關(guān)鍵作用。相比之下，迄今為止，人們對(duì)腫瘤組織的粘彈性及其與腫瘤惡性狀態(tài)的相關(guān)性知之甚少。

從基礎(chǔ)科學(xué)的角度來(lái)看，研究腫瘤的粘彈性特性也至關(guān)重要。我們提出一個(gè)基本問(wèn)題：如何從理論上對(duì)活體材料的力學(xué)特性進(jìn)行建模？最簡(jiǎn)單的固體材料類別是胡克固體，其應(yīng)力與應(yīng)變成正比。相比之下，生物材料的行為較為復(fù)雜；它們?cè)谑艿酵獠繎?yīng)力時(shí)往往會(huì)變形和適應(yīng)。例如，Ⅰ型膠原蛋白，這是一種為哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐的主要蛋白質(zhì)，就是一個(gè)例子。膠原蛋白由交聯(lián)纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，拉伸時(shí)纖維會(huì)排列，壓縮時(shí)會(huì)彎曲。這導(dǎo)致了膠原蛋白復(fù)雜的非線性和各向異性材料特性。像組織（例如細(xì)胞嵌入膠原蛋白）這樣的活體材料進(jìn)一步增加了材料的復(fù)雜性。在這里，基本成分細(xì)胞能夠感知、移動(dòng)，并且還能改變細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的結(jié)構(gòu)。例如，當(dāng)組織受到外部力時(shí)，腫瘤細(xì)胞作為機(jī)械感受器，會(huì)移動(dòng)并重新排列周圍的細(xì)胞外基質(zhì)空間結(jié)構(gòu)。在這種情況下，這為材料力學(xué)增添了又一個(gè)維度。

目前，商用的平行流變儀是表征生物材料力學(xué)特性的主要工具。在平行流變儀中，生物樣本被夾在兩個(gè)平行板之間進(jìn)行剪切或壓縮，從而獲得應(yīng)力 - 應(yīng)變關(guān)系。雖然這種設(shè)置簡(jiǎn)單直接，但其與活組織或光學(xué)成像的兼容性較差，限制了其在活體材料研究中的應(yīng)用。原子力顯微鏡通過(guò)在三維環(huán)境中進(jìn)行力測(cè)量以及具備光學(xué)兼容性解決了其中的一些問(wèn)題，但其尖端細(xì)小，僅能對(duì)單細(xì)胞局部力學(xué)特性進(jìn)行分析。微吸管抽吸技術(shù)為組織力學(xué)研究提供了有價(jià)值的見(jiàn)解，但其數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)操作頗具挑戰(zhàn)性。為了克服這些局限性，微流控平臺(tái)作為研究細(xì)胞和組織力學(xué)的工具應(yīng)運(yùn)而生，它能在生物相關(guān)的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)更好的可視化效果，并對(duì)細(xì)胞和組織的整體力學(xué)特性進(jìn)行精細(xì)控制。例如，聚二甲基硅氧烷（PDMS）微活塞系統(tǒng)和基于收縮的裝置，通過(guò)迫使聚集體通過(guò)狹窄通道來(lái)探測(cè)機(jī)械阻力。盡管這些方法都有創(chuàng)新之處，但在通量、生理相關(guān)性、空間分辨率或光學(xué)兼容性方面都存在固有的局限性。為了彌補(bǔ)這些不足，在本手稿中，我們開(kāi)發(fā)了一種綜合方法，將為組織提供生理現(xiàn)實(shí)三維環(huán)境的微流體壓縮裝置與改進(jìn)的冪律模型相結(jié)合，以研究腫瘤球體的粘彈性機(jī)械特性。

微流控裝置的關(guān)鍵能力在于能夠?qū)η度肷憩F(xiàn)實(shí)的三維細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的腫瘤球體提供可控的壓縮，并且與顯微鏡成像兼容（圖 1）。該裝置由 12 個(gè)功能單元組成，其中 6 個(gè)為控制單元，另外 6 個(gè)為壓縮單元（圖 1A）。每個(gè)單元的橫截面圖見(jiàn)圖 1B。壓縮單元的主要特征是細(xì)胞室層（L1），用于容納嵌入的球體 ECM，以及壓力控制單元（L2 + L3），可為球體提供明確的壓縮。為了校準(zhǔn)不同壓力水平下的活塞位移，我們通過(guò)測(cè)量活塞表面上 1 μm 綠色熒光珠的焦點(diǎn)位置隨施加壓力的變化來(lái)確定活塞位移（圖 1C）。簡(jiǎn)而言之，將珠子置于活塞底部，施加壓力后，活塞位移會(huì)使珠子垂直移動(dòng)并失焦。通過(guò)使用電動(dòng)載物臺(tái)重新聚焦珠子來(lái)測(cè)量位移。活塞位移與壓力的關(guān)系曲線如圖 1C 所示，與 COMSOL 計(jì)算結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，其中紅線為 COMSOL 模擬結(jié)果，點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)測(cè)量值。

圖 1：實(shí)驗(yàn)裝置及設(shè)備校準(zhǔn)。（A）完全組裝好的微流控裝置的俯視圖。該裝置共有 12 個(gè)功能單元，夾在不銹鋼框架和聚碳酸酯歧管之間。（B）一個(gè)壓縮單元的橫截面示意圖。每個(gè)單元由三層 PDMS 組成。第一層是細(xì)胞室層（L1），其中放置有嵌入膠原蛋白的球體。第二層是帶有平頂活塞形狀的可變形 PDMS 膜（L2），用于將壓力施加到表面平坦的腫瘤球體上。第三層是壓力控制室層（L3），與外部壓力控制裝置相連。L2 和 L3 粘合在一起形成壓力控制單元，以將所需壓力施加到球體上。（C）設(shè)備校準(zhǔn)?；钊钠D(zhuǎn)量與施加壓力的關(guān)系（點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，紅線為 COMSOL 計(jì)算結(jié)果）。（D）嵌入膠原蛋白的 MDA-MB-231 球體的明場(chǎng)圖像。紅色或綠色輪廓分別標(biāo)記了有壓縮和無(wú)壓縮時(shí)球體的周邊。壓縮壓力為 14 千帕。比例尺為 50 微米。（E）壓縮前后 MDA-MB-231 球體的大小分布。（F）由三種不同乳腺細(xì)胞系（惡性程度依次遞增）制成的球體在壓縮前的測(cè)量直徑：非致瘤性 MCF10A、雌激素受體陽(yáng)性致瘤性 MCF7 以及三陰性轉(zhuǎn)移性 MDA-MB-231。

在循環(huán)壓縮作用下，球體尺寸響應(yīng)表現(xiàn)出粘彈性材料特性。

為了研究腫瘤球體的粘彈性特性，我們對(duì)腫瘤球體在受控動(dòng)態(tài)壓縮下的尺寸響應(yīng)進(jìn)行了研究（圖 2）。通過(guò)壓力控制單元對(duì)球體施加一個(gè)最大壓力為 14 kPa、周期為 40 s 的方波壓力（圖 2A）。對(duì)球體的中軸平面進(jìn)行光學(xué)成像，其尺寸響應(yīng)如圖 2B 所示。利用球體圖像，我們計(jì)算了球體的歸一化面積變化，即 (A - A0) / A0，其中 A 是壓縮后中軸平面的球體面積，A0 是壓縮前的初始球體面積。仔細(xì)觀察球體面積響應(yīng)曲線，我們注意到在壓縮時(shí)，需要幾秒鐘才能達(dá)到近似穩(wěn)態(tài)；在解除壓縮時(shí)，面積變化先出現(xiàn)一個(gè)跳躍，然后逐漸松弛到一個(gè)較低的近似穩(wěn)態(tài)（圖 2B）。兩種細(xì)胞類型都表現(xiàn)出即時(shí)變形（彈性響應(yīng)），隨后隨著時(shí)間的推移變形逐漸增加（粘性響應(yīng)）。

圖 2：球體大小響應(yīng)曲線遵循冪律（A）施加于壓力控制單元的方波壓力，最大壓力為 14 千帕，周期為 40 秒。（B）在（A）所示方波壓力的周期性壓縮下，惡性腫瘤球體和非惡性腫瘤球體的歸一化腫瘤球體面積變化。此處，MDA-MB-231 球體的直徑為 154.20 ± 4.07 微米，MCF10A 為 143.14 ± 6.2 微米。（C）使用（B）中的數(shù)據(jù)計(jì)算出的惡性（MDA-MB-231）腫瘤球體的應(yīng)變響應(yīng)。作為參考，添加了一條棕色線以顯示純彈性材料的應(yīng)變響應(yīng)。該圖改編自 53。（D-E）MDA-MB-231（D）和 MCF10A（E）球體的歸一化球體面積變化響應(yīng)曲線。點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，線為線性函數(shù)擬合。α 為擬合斜率，R2 為擬合優(yōu)度，其中 1 表示完美擬合。（F）三種不同細(xì)胞系的應(yīng)變響應(yīng)曲線斜率。星號(hào)是通過(guò)非參數(shù) t 檢驗(yàn)（曼 - 惠特尼檢驗(yàn)，****：P < 0.0001，***：P < 0.001，**：P < 0.01，*：P < 0.05）獲得的。

為了評(píng)估腫瘤球體的粘彈性，我們重點(diǎn)關(guān)注應(yīng)變響應(yīng)曲線的松弛階段。具有單一時(shí)間尺度的線性粘彈性材料的一個(gè)重要特征是，對(duì)恒定壓縮突然釋放的應(yīng)變響應(yīng)呈指數(shù)衰減。在這里，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤球體的松弛響應(yīng)在對(duì)數(shù) - 對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖上呈現(xiàn)出明顯的冪律關(guān)系。這表明響應(yīng)曲線涉及多個(gè)時(shí)間尺度。

圖 3：通過(guò)修正冪律模型揭示的腫瘤球體的粘彈性特性。（A）三種不同惡性程度的腫瘤球體的實(shí)驗(yàn)應(yīng)變響應(yīng)曲線。圓圈表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，線條表示修正冪律模型的擬合結(jié)果。此處應(yīng)變定義為?h/h，其中 h 為球體的垂直高度，通過(guò)圖 2 所示的面積變化數(shù)據(jù)計(jì)算得出。（B）使用（A）中的應(yīng)變響應(yīng)曲線和修正冪律模型計(jì)算得出的三種類型球體的應(yīng)力松弛曲線。虛線表示應(yīng)力降至初始值一半時(shí)的時(shí)間位置。圖 3A 中的擬合數(shù)據(jù)和 3B 中的應(yīng)力松弛曲線均來(lái)自每種細(xì)胞系的單個(gè)球體。（C）三種類型球體的半松弛時(shí)間。MDA-MB-231 球體的平均值為 5.571 ± 1.34 秒，MCF 7 為 3.636 ± 0.693 秒，MCF10A 為 1.488 ± 0.488 秒。（D）在一定頻率范圍內(nèi)計(jì)算得出的球體有效粘度。星號(hào)是通過(guò)非參數(shù) t 檢驗(yàn)（曼 - 惠特尼檢驗(yàn)，****：P < 0.0001，***：P < 0.001，**：P < 0.01，*：P < 0.05）獲得的。

塑性是指生物材料在外力作用下產(chǎn)生的永久變形，是其重要特性之一。在腫瘤中，組織塑性通常與腫瘤惡性進(jìn)展和侵襲相關(guān)。為了量化塑性，我們使用 40 分鐘的方波壓力對(duì)球體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間周期性壓縮，并監(jiān)測(cè)其應(yīng)變松弛情況。在所有三種細(xì)胞系中，球體應(yīng)變?cè)趬嚎s過(guò)程中持續(xù)增加，而在釋放后，應(yīng)變并未恢復(fù)到初始值（圖 4A1、B1、C）。為了量化這一現(xiàn)象，我們通過(guò)計(jì)算兩個(gè)連續(xù)周期末的應(yīng)變差來(lái)測(cè)量殘余應(yīng)變（見(jiàn)圖 4A1）。殘余應(yīng)變反映了球體在每次壓縮周期后累積的不可逆變形。我們發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞系和非惡性細(xì)胞系之間的殘余應(yīng)變存在顯著差異。

圖 4：長(zhǎng)期壓縮下腫瘤球體的可塑性由球體大小響應(yīng)曲線揭示。（A1）MDA-MB-231 腫瘤球體在循環(huán)壓縮下的歸一化球體面積變化。（A2）MDA-MB-231 球體壓縮階段數(shù)據(jù)的線性擬合。（B1）MCF10A 球體在循環(huán)壓縮下的歸一化球體面積變化。（B2）MCF10A 球體壓縮階段數(shù)據(jù)的線性擬合。（C）循環(huán)壓縮第 2 周期與第 1 周期應(yīng)變恢復(fù)之差計(jì)算得出的平均殘余應(yīng)變（在 A1 中以圖形形式展示）。（D）所有不同腫瘤球體在壓縮階段的球體膨脹率。所有球體均嵌入 1.5 毫克/毫升的膠原蛋白基質(zhì)中，并施加最大壓力為 14 千帕的方波，周期為 40 分鐘。星號(hào)是通過(guò)非參數(shù) t 檢驗(yàn)（曼 - 惠特尼檢驗(yàn)，****：P < 0.0001，***：P < 0.001，**：P < 0.01，*：P < 0.05）獲得的。

在這項(xiàng)工作中，我們利用集成的微流控壓縮裝置和理論模型研究了乳腺腫瘤球體的粘彈性特性。我們的研究結(jié)果表明，處于三種不同惡性狀態(tài)的乳腺腫瘤球體遵循修正后的冪律模型。值得注意的是，它們的機(jī)械表型隨惡性狀態(tài)顯著變化：在施加恒定壓縮應(yīng)變后釋放時(shí)，非致瘤性腫瘤球體在短時(shí)間尺度（秒）內(nèi)恢復(fù)迅速，表現(xiàn)出更彈性的行為，并且在長(zhǎng)時(shí)間尺度（分鐘）內(nèi)產(chǎn)生的永久變形（塑性）比惡性腫瘤球體少。這些觀察結(jié)果與先前的研究一致，先前的研究表明穩(wěn)定的細(xì)胞骨架和更強(qiáng)的 e-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附與較低的侵襲性相關(guān)。

這里所采用的修正冪律模型為涉及多個(gè)時(shí)間尺度的活體材料建模提供了一種簡(jiǎn)單通用的方法。未來(lái)，我們計(jì)劃分別探究不同時(shí)間尺度下的生物活動(dòng)，包括細(xì)胞骨架分子動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和細(xì)胞遷移，以理解此處呈現(xiàn)的多時(shí)間尺度動(dòng)態(tài)的本質(zhì)。我們還希望修正冪律模型能夠用于表征其他組織類型的力學(xué)特性，從而進(jìn)一步了解活體組織粘彈性特征的生物學(xué)意義。

參考文獻(xiàn)：

Pandey M, Zhu B, Roach K, Suh YJ, Segall JE, Hui CY, Wu M. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. ArXiv [Preprint]. 2025 Sep 22:arXiv:2509.17294v1. 

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