在您試圖了解腫瘤侵襲性的差異時，很容易錯過那些隱藏在復雜腫瘤微環(huán)境中的微小異質(zhì)性，比如上圖乳腺癌樣本中的一小塊三陽性區(qū)域。在這篇文章中，我們將講述Xenium原位分析技術如何發(fā)現(xiàn)這種被其他方法遺漏的獨特的癌癥生物學特征。

兩個看似相同的腫瘤

一個腫瘤是非侵襲性的，相對無害

另一個卻逐漸形成侵襲性，變成有害的侵襲性腫瘤

為什么？

答案很簡單：異質(zhì)性，但異質(zhì)性本身卻并不簡單...

盡管癌癥是Z臭名昭著的例子，但患者之間和患者自身的異質(zhì)性是所有疾病面臨的難題。事實上，即使在健康狀態(tài)下，絕大多數(shù)的人類生物學功能的正常行使也需要細胞異質(zhì)性。細胞異質(zhì)性的評估因幾方面的挑戰(zhàn)而變得復雜。首先，小的分子波動可能導致大的功能變化(1)。其次，基因組水平的異質(zhì)性可能不會轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組或結(jié)構(gòu)水平，反之亦然(2)。此外，空間背景會大大影響異質(zhì)性。異質(zhì)性很難用傳統(tǒng)方法來解析，但在將單細胞數(shù)據(jù)的強大分辨率與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的形態(tài)學背景相整合后，研究人員在捕捉這種復雜生物學現(xiàn)象的驅(qū)動因素方面取得了很大進展。這種方法計算量大，仍然依賴于推斷而不是直接觀察。盡管這些整體轉(zhuǎn)錄組分析對科學探索很有幫助，但仍需要深入研究這些方法所發(fā)現(xiàn)的感興趣基因，才能真正了解其意義。那么，如果有一種方法能夠?qū)渭毎直媛实牧α颗c空間基因表達的形態(tài)學背景融合到單個實驗中，又會怎么樣？

想象一下，您是一名研究人員，上圖這份導管原位癌（DCIS）樣本正出現(xiàn)在您的工作臺上，并有機會采用Xenium原位分析。您會在分析中發(fā)現(xiàn)什么？根據(jù)H&E染色后的傳統(tǒng)組織病理學評估，這份乳腺腫塊粗針穿刺活檢樣本被注釋為HER2+/ER+/PR- (4)。也就是說，這份樣本表達人類表皮生長因子受體2（HER2/ERBB2）和雌激素受體（ER/ESR1），但不表達孕酮受體（PR/PGR）。為了生成亞細胞分辨率的基因表達圖譜，我們采用高度特異且靈敏的可環(huán)化鎖式探針來檢測感興趣的RNA轉(zhuǎn)錄本。這個樣本經(jīng)過10x Genomics公司Xenium人類乳腺基因表達panel（包含313個基因的探針）處理，反映了以往在單細胞圖譜數(shù)據(jù)中描述的致瘤和健康人類乳腺組織的狀態(tài)(5-7)。

回顧圖2A所示的Xenium空間結(jié)果中的ESR1、ERBB2和PGR表達，發(fā)現(xiàn)所分析的組織切片的大部分區(qū)域同時表達ERBB2和ESR1轉(zhuǎn)錄本（HER2/ER雙陽性），或只表達ERBB2轉(zhuǎn)錄本（HER2陽性）。然而，Xenium也發(fā)現(xiàn)了一小塊區(qū)域，大約5.5 mm x 7.5 mm，呈現(xiàn)出ERBB2、ESR1和PGR轉(zhuǎn)錄本的三陽性表達（HER2+/ER+/PR+；圖2A-D）?？紤]到受體狀態(tài)可用來預測患者預后，鑒定這個獨特的三陽性區(qū)域的能力有多重要，相信已經(jīng)不言而喻。

為了全面研究組織生物學，Xenium原位分析將強大的單分子RNA測序與空間解碼技術相結(jié)合，能夠以亞細胞分辨率快速檢測整張組織切片中的數(shù)百個至數(shù)千個RNA靶點。這種類型的分析不僅能在生物學背景下對細胞進行定位和分型，還能解決細胞間通訊的問題，分析細胞微環(huán)境并鑒定罕見的細胞浸潤。Xenium通過獨特的四因素認證化學方法，帶來了高特異性。每個靶點都是利用掛鎖式探針鑒定的。

這些探針必須滿足以下條件：

兩條臂與靶點穩(wěn)定雜交（第1步和第2步）

探針末端彼此連接，形成一個環(huán)狀探針（第3步）

成功完成這個環(huán)狀探針的滾環(huán)擴增（第4步）

這種方法的靈敏度很高，足以區(qū)分高同源性的RNA，并檢測低表達的轉(zhuǎn)錄本。Xenium高靈敏度的化學方法與亞細胞空間分辨率的組合對于這種三陽性區(qū)域的檢測至關重要。

在檢測過程中，熒光標記的探針自動進入循環(huán)、孵育、成像，并被儀器去除。在儀器運行結(jié)束后，數(shù)據(jù)即被整合，建立起整張組織切片的轉(zhuǎn)錄本空間圖譜。Xenium對整張組織切片的高分辨率分析是促成這個（三陽性）區(qū)域被鑒定出的另一個重要因素。在此次分析中，三陽性區(qū)域大約只有0.1 mm2，而總面積為42 mm2。這個稀疏的區(qū)域?qū)Ψ前邢蚧虻头直媛史椒▉碚f是一大挑戰(zhàn)。此外，由于一些空間技術只能對實驗前預先選擇的感興趣區(qū)域進行分析，那么這個小區(qū)域就很容易被忽略，因為以往沒有辦法知道它包含獨特的生物學特征。

Xenium原位分析的另一個強大優(yōu)勢在于它能夠在Xenium運行后對同一組織切片進行免疫熒光染色（圖4）。這種功能之所以能夠?qū)崿F(xiàn)，是因為儀器上非破壞性的生化和解碼循環(huán)保留了蛋白質(zhì)表位。盡管一些空間技術能夠提供RNA和蛋白表達的分析，但其中許多需要使用連續(xù)的載玻片來分析不同的分析物類型，這使得分析物無法同時實現(xiàn)大規(guī)?？梢暬?。在Xenium處理過程中，組織的完整性得以保留，這意味著在Xenium處理后也可以進行H&E染色（圖2C）。獲得同一張組織切片的組織病理學、蛋白表達和基因表達數(shù)據(jù)，可幫助您更全面地了解樣本的生物學特征。

在探究腫瘤是否會繼續(xù)保持良性還是轉(zhuǎn)變成侵襲性這樣的復雜生物學問題時，大海撈針有時似乎比破譯癌癥背后的分子機制要簡單一些。然而，每一個新的生物學機制都有可能改變我們診斷癌癥的方式，甚至在某一天還能治愈癌癥。

參考資料：

1. Chang AY & Marshall WF. Organelles – understanding noise and heterogeneity in cell biology at an intermediate scale. J Cell Sci 130: 819–826 (2017). doi: 10.1242/jcs.181024

2. Goldman SL, et al. The impact of heterogeneity on single-cell sequencing. Front Genet 10: 8 (2019). doi: 10.3389/fgene.2019.00008 

3. Moses L & Pachter L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods 19: 534–546 (2022). doi: 10.1038/s41592-022-01409-2 

4. Janesick A, et al. High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue. bioRxiv (2022). doi: 10.1101/2022.10.06.510405 

5. Pal B, et al. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. The EMBO Journal. 40: e107333 (2021). doi: 10.15252/embj.2020107333 

6. The American Cancer Society. (2021, November 8). Breast cancer hormone receptor status. Understanding a breast cancer diagnosis. Retrieved April 13, 2023, from https://www.cancer.org/cancer/breast-cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnosis/breast-cancer-hormone-receptor-status.html 

7. Dunnwald LK, Rossing MA & Li CI. Hormone receptor status, tumor characteristics, and prognosis: a prospective cohort of breast cancer patients. Breast Cancer Res 9: R6 (2007). doi: 10.1186/bcr1639

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