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2025-01-21 09:30:33光聲顯微成像技術(shù): 光聲顯微成像技術(shù)是一種結(jié)合了光學(xué)激發(fā)與超聲探測(cè)的成像方法。該技術(shù)利用短脈沖激光照射樣品，樣品吸收光能后產(chǎn)生熱膨脹并發(fā)出超聲波，通過探測(cè)這些超聲波，可以重建出樣品內(nèi)部的光吸收分布圖像，從而實(shí)現(xiàn)高分辨率、高對(duì)比度的顯微成像。光聲顯微成像在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，能夠無創(chuàng)、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)生物組織的功能代謝變化及材料的微觀結(jié)構(gòu)特征。

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“自適應(yīng)雙光子激發(fā)光聲顯微成像設(shè)備”順利通過現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)測(cè)試

近日，中國科學(xué)院自動(dòng)化研究所科承擔(dān)的“自適應(yīng)雙光子激發(fā)光聲顯微成像設(shè)備”項(xiàng)目通過技術(shù)測(cè)試和財(cái)務(wù)審查。

4100
2020-06-28
雙光子激發(fā) 光聲顯微成像技術(shù) 顯微成像設(shè)備

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光聲顯微成像技術(shù)問答

2025-02-17 14:30:16多光譜光聲斷層掃描成像原理是什么？: 多光譜光聲斷層掃描成像：開創(chuàng)醫(yī)學(xué)影像的新篇章多光譜光聲斷層掃描成像（MSPAT）是一項(xiàng)革命性的成像技術(shù)，結(jié)合了光學(xué)和超聲波的優(yōu)勢(shì)，能夠提供高分辨率的圖像，且具有較高的深度穿透能力。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，MSPAT在醫(yī)學(xué)成像、癌癥檢測(cè)、腦部研究等領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用潛力。本篇文章將深入探討多光譜光聲斷層掃描成像的原理、優(yōu)勢(shì)及其在臨床診斷中的應(yīng)用。光聲效應(yīng)與成像原理多光譜光聲斷層掃描成像的核心原理是基于光聲效應(yīng)。當(dāng)激光光源照射到組織中時(shí)，組織中的水分和血紅蛋白會(huì)吸收特定波長(zhǎng)的光，導(dǎo)致局部溫度升高并產(chǎn)生快速的熱膨脹。這個(gè)過程會(huì)激發(fā)聲波的產(chǎn)生，聲波的強(qiáng)度和頻率可以通過超聲探頭進(jìn)行探測(cè)，從而反映出組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和成分。多光譜光聲斷層掃描成像之所以能稱為“多光譜”，是因?yàn)樗褂昧瞬煌ㄩL(zhǎng)的激光源，從而可以獲得組織的不同光學(xué)特性。這種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，它能夠獲取更豐富的組織信息，識(shí)別不同的組織成分，如血管、腫瘤以及其他病變區(qū)域。多光譜光聲斷層掃描成像的優(yōu)勢(shì) 相比傳統(tǒng)的成像技術(shù)，如CT（計(jì)算機(jī)斷層掃描）和MRI（磁共振成像），多光譜光聲斷層掃描成像具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。MSPAT能夠以較高的分辨率提供結(jié)構(gòu)性圖像，這在微小病變的早期發(fā)現(xiàn)上至關(guān)重要。尤其是在腫瘤檢測(cè)方面，MSPAT能有效區(qū)分腫瘤組織和健康組織，有助于提高腫瘤早期篩查的準(zhǔn)確性。 MSPAT能夠在不使用放射線的情況下，獲得豐富的血管信息。傳統(tǒng)的成像技術(shù)需要注射對(duì)比劑來突出血管的顯現(xiàn)，而MSPAT則通過不同波長(zhǎng)的激光照射，可以無創(chuàng)性地提供關(guān)于血管的詳細(xì)信息，且能夠深入體內(nèi)組織層次，幫助醫(yī)生更好地評(píng)估腫瘤的血供狀況或病變的演變過程。臨床應(yīng)用前景在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，MSPAT已經(jīng)展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，尤其在腫瘤檢測(cè)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷中。通過對(duì)腫瘤組織的精確成像，醫(yī)生可以更加準(zhǔn)確地評(píng)估腫瘤的大小、位置以及血供情況，從而為方案的制定提供重要依據(jù)。MSPAT也在腦血管病變、腦部腫瘤等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，幫助醫(yī)生獲取更加直觀的病變圖像，輔助早期診斷和治果評(píng)估。未來，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，MSPAT的應(yīng)用范圍將進(jìn)一步擴(kuò)展。尤其是與人工智能結(jié)合的進(jìn)展，MSPAT的圖像分析將更加，能夠幫助醫(yī)生在極短的時(shí)間內(nèi)做出更加科學(xué)的診斷決策，極大地提高醫(yī)率和診斷準(zhǔn)確率。結(jié)論多光譜光聲斷層掃描成像作為一項(xiàng)創(chuàng)新的成像技術(shù)，憑借其高分辨率、無創(chuàng)性和多波長(zhǎng)成像的優(yōu)勢(shì)，正在醫(yī)學(xué)影像領(lǐng)域中占據(jù)越來越重要的地位。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，MSPAT將在腫瘤篩查、腦部疾病診斷等方面展現(xiàn)出更加廣泛的應(yīng)用潛力，并有望成為未來醫(yī)學(xué)影像的主流技術(shù)之一。

2022-07-20 13:38:49光聲成像材料 | 腫瘤微環(huán)境激活的光聲成像顯影劑: 在生物成像和光診療學(xué)領(lǐng)域，通過對(duì)材料的結(jié)構(gòu)調(diào)整以控制其光學(xué)性質(zhì)是探索新材料，發(fā)現(xiàn)新應(yīng)用的重要且常見方式。貴金屬就是其中較為主要的一類原料，但通常的貴金屬材料存在兩個(gè)明顯缺點(diǎn)：一、激發(fā)波長(zhǎng)通常落在可見光和近紅外一區(qū)（NIR-I，700 – 1000 nm），這使得成像的深度降低，同時(shí)無法與組織發(fā)生明顯的作用；二、該類材料通常不具備激活功能（即始終在線，Always-on），使得難以從成像中分辨目標(biāo)和其他無關(guān)組織，同時(shí)可能會(huì)存在未知副反應(yīng)。在這樣的背景下，作者Chunyu Zhou等人將目標(biāo)放在更高信噪比、更大成像深度的近紅外二區(qū)（NIR-II，1000 – 1700 nm），開發(fā)能夠?qū)δ[瘤微環(huán)境進(jìn)行響應(yīng)的貴金屬納米材料。該材料以金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）為主體（見圖1），在乙醇和水的混合體系中使其形成納米鏈（Nanochain）。之后引入Tetraethyl orthosilicate，（TEOS），水解后包裹金納米鏈，形成核鞘結(jié)構(gòu)（Core-sheath nanostructure，AuNCs@SiO2）。注射至小鼠體內(nèi)后，因腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）中高H2O2水平觸發(fā)鄰近金納米顆粒在AuNCs@SiO2的有限局部空間內(nèi)融合，從而產(chǎn)生了具有強(qiáng)NIR-II吸收的串狀結(jié)構(gòu)。圖1：AuNCs@SiO2作用示意圖因AuNCs@SiO2具有TME激活特性，因此不容易受其他組織的影響，表現(xiàn)出優(yōu)異的光聲成像性能（圖2）。圖2：正常組織與腫瘤組織的超聲、光聲成像對(duì)比同時(shí)，AuNCs@SiO2在1064 nm處光熱轉(zhuǎn)換效率高達(dá)82.2%（圖3），可導(dǎo)致癌細(xì)胞嚴(yán)重死亡，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖4、5、6）。圖3：AuNCs@SiO2與其他已報(bào)道的光熱治療試劑的轉(zhuǎn)換效率對(duì)比：1) AuNCs@SiO2; 2) Au3Cu@PEG TPNCs; 3) Au-wires-on-AuNR; 4) Pt Spiral; 5) Cu2MnS2 NPs; 6) Nb2C (Mxene); 7) Cu3BiS3 NRs; 8) L-Pdots; 9) TBDOPV-DT NPs; 10) SPN-DT圖4：注射PBS和AuNCs@SiO2的荷4T1瘤小鼠光熱紅外熱成像（1064 nm NIR-II激光，0.5 W/cm2）圖5：注射PBS和AuNCs@SiO2后，腫瘤部位溫度與照射時(shí)長(zhǎng)的變化趨勢(shì) 圖6：接受相應(yīng)治療后的小鼠腫瘤大小對(duì)比（I：PBS；II：AuNCs@SiO2；III：PBS+Laser；IV：AuNCs@SiO2+Laser）總結(jié)：作者成功合成出具有TME響應(yīng)的、同時(shí)具有光聲成像和光熱治療功能的二氧化硅包裹自組裝金納米鏈。通過TME中高濃度H2O2水，使金納米粒子表面檸檬酸氧化，進(jìn)而脫離納米粒子表面，導(dǎo)致金納米粒子融合，產(chǎn)生強(qiáng)NIR-II吸收。這一新型材料或許能夠?yàn)闇?zhǔn)確非侵入性診療打開新的大門。美國PhotoSound 小動(dòng)物3D光聲/熒光成像系統(tǒng) (PAFT) 美國PhotoSound小動(dòng)物全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)(PAFT)為小動(dòng)物活體成像和表征提供了完整的解決方案。該系統(tǒng)集成了三種互補(bǔ)的三維成像模式：光聲成像(PAT)、熒光成像(FMT)、生物發(fā)光成像(BLT)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物的3D光聲、3D熒光和3D生物發(fā)光成像,該系統(tǒng)可為生物組織提供高分辨率、高對(duì)比的解剖學(xué)成像效果。可實(shí)現(xiàn)近紅外一區(qū)和近紅外二區(qū)（670-2600 nm）小鼠全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)，采用OPO可調(diào)式激光器，提供670-2600 nm連續(xù)脈沖激光、完全3D光聲成像(具有100 um等向分辨率的完全三維成像，非切片疊加成像)、高通量 (256個(gè)電子通道)、靈敏度高(60 nM ICG )、桌面式設(shè)計(jì)，方便使用、成像速度快 (完成一次3D掃描需30秒)。往期回顧● 美國PhotoSound小動(dòng)物全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)● 小鼠解剖應(yīng)用筆記 —— 美國PhotoSound小動(dòng)物全身3D光聲/熒光成像系統(tǒng)● 光聲成像應(yīng)用 | 探尋動(dòng)脈粥樣硬化斑塊

2022-10-28 10:18:55光聲應(yīng)用 | 腎小管間質(zhì)纖維化診斷: 背景慢性腎病，以其高發(fā)生率和強(qiáng)大的潛伏性，已越來越成為一種常見的疾病。如果能夠及時(shí)地檢測(cè)到該疾病的發(fā)生進(jìn)程，將大大改善后續(xù)的醫(yī)療成效。在眾多病理特征中，腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis）作為眾多腎臟疾病發(fā)展進(jìn)程中的常見中間體，是反映腎臟狀態(tài)的重要指標(biāo)。目前，臨床方法仍然只能做到減緩病程，并不能阻止或者扭轉(zhuǎn)疾病對(duì)于組織的破壞。因此，醫(yī)療和科研工作人員將注意力放在了疾病的早期階段——如果能在該階段確定病變，則有更大的幾率阻止疾病惡化。研究思路在此背景下，Dingyuan等人嘗試對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。傳統(tǒng)的方法使用的腎活組織切片（Kidney biopsy）容易導(dǎo)致大量出血，因而作者更偏向于非接觸式檢測(cè)。而在該領(lǐng)域，通常選用CT、核磁共振等方式，但這些方式輻射風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大，因此作者選擇了光聲/熒光成像方式。而在顯影劑的選擇上，相對(duì)于無機(jī)材料，有機(jī)材料具有更好的生物降解能力、純度以及聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)（Aggregation-induced emission, AIE）——一種在溶液中分散時(shí)幾乎不發(fā)光，但在聚集狀態(tài)時(shí)發(fā)光大大增強(qiáng)的現(xiàn)象——因而被作者看中。同時(shí)，現(xiàn)有的大部分具有AIE的光聲顯影劑為疏水性材料，不利于均勻分散和體內(nèi)代謝，因此作者開發(fā)了一款水溶性AIE腎小管間質(zhì)纖維化檢測(cè)顯影劑。顯影劑設(shè)計(jì)及表征作者首先獲得的是AIE-4COOH分子——一個(gè)攜帶4個(gè)羧基的具有AIE效應(yīng)的分子。為了增加其水溶性，作者將4個(gè)羧基全部PEG化，成為AIE-4PEG550。AIE-4PEG550在DMSO/水體系中溶解良好，并能夠自組裝形成納米粒子（AIE-4PEG550 NPs，圖1）。表征結(jié)果顯示該粒子有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一、粒徑約26 nm，質(zhì)量約3.3 kDa，能夠有效通過腎臟的濾過作用（截留質(zhì)量通常為30-50 kDa）；二、光穩(wěn)定性好：在660 nm波長(zhǎng)持續(xù)照射30 min后，僅有微小強(qiáng)度下降，而作為對(duì)照的顯影劑ICG則已完全猝滅。在645 nm處具有強(qiáng)吸收峰，而發(fā)射峰則在893 nm。圖1 AIE-4PEG550納米粒子設(shè)計(jì)思路圖2 AIE-4PEG550 NPs的左）吸收、發(fā)射圖譜；右）粒徑檢測(cè)（溶液均為水）體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體外實(shí)驗(yàn)著眼于該有機(jī)分子的生物兼容性。在0 – 100 μg/mL該分子溶液中孵育24 h后，HK-2細(xì)胞（Human kidney -2，人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞）的存活率仍在95%以上（圖3）。圖3 在不同濃度AIE-4PEG550 NPs環(huán)境下孵育的HK-2細(xì)胞存活率在正常體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，作者同時(shí)進(jìn)行了熒光和光聲成像，相互驗(yàn)證了該顯影劑主要聚集于腎臟而非肝臟（圖4），隨著時(shí)間流逝，腎臟中的含量逐漸降低，膀胱中的含量逐漸增加，表明該顯影劑可由腎臟代謝，并由尿液排出。測(cè)得的24 h清除效率為93.1 ± 1.7%（圖5）。圖4 在注射顯影劑后，腎臟的熒光（A）和光聲（B）、膀胱的熒光（C）和光聲（D）隨時(shí)間的成像效果變化。在腎臟中，4 min達(dá)到頂峰，而在膀胱中，60 min達(dá)到頂峰。E和F分別為相應(yīng)的數(shù)值變化柱狀圖圖5 腎臟清除效率隨注射后時(shí)間變化曲線（每只小鼠200 μg劑量，n = 3）而在腎病模型小鼠上，同樣的劑量表現(xiàn)出截然不同的結(jié)果：直到180 min之前，腎臟中的顯影劑含量一直在增加，說明腎臟代謝功能降低，本該代謝到膀胱的化合物積聚在腎臟中（圖6），這一現(xiàn)象也在相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度上有所驗(yàn)證（圖7）。通過這種區(qū)別，能夠較為直觀地評(píng)估腎臟代謝功能。圖6 在注射顯影劑后，腎臟的熒光（A）和光聲（B、C）、膀胱的熒光（D）和光聲（E、F）隨時(shí)間的成像效果變化。圖7 腎病模型小鼠注射顯影劑后180 min的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化（紅：腎臟；藍(lán)：膀胱）小結(jié)作者設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種新型熒光/光聲顯影劑，其優(yōu)點(diǎn)主要有：一、體積小，可通過腎臟過濾；二、腎臟清除效率較高；三、得益于AIE效應(yīng)，成像效果優(yōu)異；四、良好的生物兼容性；五、優(yōu)良的光穩(wěn)定性。在文獻(xiàn)中，作者將其應(yīng)用于非侵入式地診斷腎小管間質(zhì)纖維化情況，祝愿在不久的將來，這項(xiàng)技術(shù)可以用于臨床，幫助醫(yī)生快速診斷腎臟功能，從而幫助患者更好地恢復(fù)。參考文獻(xiàn)[1] Yan, D., Li, T., Yang, Y., Niu, N., Wang, D., Ge, J., Wang, L., Zhang, R., Wang, D. and Tang, B.Z. (2022), A Water-soluble AIEgen for Noninvasive Diagnosis of Kidney Fibrosis via SWIR Fluorescence and Photoacoustic Imaging. Adv. Mater.. Accepted Author Manuscript 2206643. https://doi.org/10.1002/adma.202206643

2022-09-21 10:47:13明美熒光顯微成像解決方案: （1）醫(yī)院真菌、婦科等常規(guī)熒光檢測(cè)推薦：MF52-N/MF31+普通顯微鏡相機(jī)MSX1/MC50-S/MS60/MD50等? 數(shù)顯LED熒光模塊，可定制的單色或三色激發(fā)，推拉式切換，即開即用? 高數(shù)值孔徑熒光物鏡，高清晰度與高熒光透過率? 可拍攝數(shù)字圖片，方便出具報(bào)告，可合成多色熒光圖像（2）高校、研究所等科研研究，醫(yī)院癌癥復(fù)核等高要求檢測(cè)推薦：MF53-N/MF43-N + MG100/MG120 + 高靈敏度相機(jī)MC50-S/MS23/MSH12? 研究級(jí)熒光顯微鏡機(jī)身，具備更好的熒光效果和更強(qiáng)的擴(kuò)展性能，應(yīng)對(duì)各種需求? 6孔轉(zhuǎn)盤式熒光附件，可按需自主選擇激發(fā)塊，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種熒光染料觀測(cè)? 可定制雙通等特殊濾光片組，實(shí)現(xiàn)效率更高的FISH等觀察應(yīng)用需求? LED激發(fā)光源，大功率寬光譜激發(fā)效果好，即開即用使用便捷，壽命長(zhǎng)性價(jià)比高? 高靈敏度相機(jī)，效率更高得實(shí)時(shí)反饋動(dòng)態(tài)圖像，搭配軟件可實(shí)現(xiàn)FISH等應(yīng)用（4）四家品牌普通顯微鏡升級(jí)熒光觀察推薦：數(shù)顯熒光模塊，或批量定制熒光模塊? 可適配四、品牌大部分無限遠(yuǎn)光學(xué)顯微鏡，高性價(jià)比升級(jí)熒光觀察? 數(shù)顯屏幕，直觀顯示當(dāng)前波段和亮度，方便定量分析? 內(nèi)置LED熒光光源，可選單色或BGU等三色激發(fā)，可選電動(dòng)切換或四色激發(fā)（5）四家品牌熒光顯微鏡升級(jí)LED熒光光源或定制熒光激發(fā)塊推薦：寬光譜大功率熒光光源MG-120，四通道光源MG-120? 可匹配四家品牌主流熒光顯微鏡，覆蓋可見光激發(fā)光譜，激發(fā)效果穩(wěn)定? 觸屏控制器，直觀易用的操作體驗(yàn)，可加入人走燈滅等智能功能? 壽命長(zhǎng)，即開即用，1個(gè)LED光源頂50個(gè)汞燈，無需預(yù)熱? 光強(qiáng)調(diào)節(jié)高度線性，MG-120支持軟件觸發(fā)和TTL電平脈沖模式觸發(fā)來源：https://www.mshot.com/article/1527.html

2022-11-23 10:51:20免疫熒光顯微成像詳解（上）——免疫熒光原理、步驟: 前言免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)，它是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。直接法將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。間接法如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。一、實(shí)驗(yàn)步驟免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括樣片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育、封片及熒光檢測(cè)等。1、樣品準(zhǔn)備對(duì)于單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過（70%乙醇中浸泡）的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片即可，操作過程要小心，防止細(xì)胞脫片。對(duì)于懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，有兩種方式，一種是取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片，把細(xì)胞片浸入封閉液中固定，封閉后滴加一抗和二抗孵育；另一種是先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色，離心洗脫后，用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)抗體孵育。對(duì)于冰凍切片制備，建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。組織一定要冷凍適度，切片時(shí)選用干凈鋒利的刀片，防止裂片和脫片。對(duì)于石蠟切片的制備，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)的處理。2、固定做好切片并風(fēng)干后立即用合適的固定液（固定液包括有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑，其選擇取決于抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性）進(jìn)行固定，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。固定時(shí)間則取決于固定組織切片的大小和類型，對(duì)大多數(shù)組織，18-24h即可，而細(xì)胞的固定時(shí)間較短。3、通透針對(duì)胞內(nèi)抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透劑進(jìn)行通透，這一步的目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)。4、封閉為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用封閉液（一般包括與二抗同一來源的血清、BSA或者羊血清）封閉，減弱背景著色。封閉開始后，要注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。5、一抗孵育一抗孵育溫度一般分為：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果更佳；孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃孵育1-2h，4℃過夜（從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min）。具體條件還要根據(jù)樣品、稀釋液等條件進(jìn)行摸索嘗試。6、熒光二抗孵育熒光二抗孵育一般在室溫或37℃孵育30min-1h，該過程必須在避光環(huán)境下進(jìn)行，防止熒光淬滅。熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)采用小包裝并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。7、復(fù)染一般采用DAPI進(jìn)行復(fù)染，目的是形成細(xì)胞輪廓，從而對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。8、封片為了長(zhǎng)期保存，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行封片，用吸水紙吸干爬片上的液體，一般用緩沖甘油等或?qū)ｉT的抗熒光淬滅的封片液。9、熒光觀察有條件的話立即用熒光顯微鏡觀察拍照，若不能及時(shí)拍照，也要做好封片和封固，保持避光和濕度。熒光顯微鏡的成像能力對(duì)最終的結(jié)果也會(huì)造成很大的影響，好的熒光顯微鏡能夠最大限度地收集熒光信號(hào)，并呈現(xiàn)高分辨率的圖片，使細(xì)節(jié)更清楚，更易得到一張效果極佳的結(jié)果圖。注意：切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。(1)單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染；(2)溫柔沖洗，防止切片的脫落。可使用浸洗方式；(3)沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)；(4)PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求（建議PH在7.4-7.6，濃度是0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）。根據(jù)上述步驟完成免疫熒光實(shí)驗(yàn)后，就需要進(jìn)行熒光顯微成像，得到我們想要的結(jié)果。選擇一款操作簡(jiǎn)單、成像清晰、效果卓越的熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照，才能輕松得到更為理想的結(jié)果圖，達(dá)到事半功倍的效果。Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡作為一款電動(dòng)化、智能化的顯微鏡，具有以下優(yōu)勢(shì)：? 正倒置一體快速切換：切片、細(xì)胞觀察隨心切換，無懼任何耗材；? DHR數(shù)字降噪功能：極大地降低了背景噪音和熒光干擾，提高圖像銳度，加深細(xì)節(jié)，得到分辨率更高的圖片；? 強(qiáng)大的Z-Stacking功能：通過高精度電動(dòng)化Z軸層掃來擴(kuò)大景深，解決厚樣本觀察問題，提高圖像分辨率；? 500MP單色相機(jī)：能夠采集更多熒光信號(hào)，助力低熒光強(qiáng)度樣本觀察；? 多通道熒光自動(dòng)拍攝疊加功能：可自動(dòng)進(jìn)行多通道成像的疊加，個(gè)性化選擇查看/保存各通道的組合圖像。