蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）就是Western Blot。作為一種實(shí)驗(yàn)方法。它常被用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中。生物組織樣品或者凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)特異性抗體著色，通過(guò)對(duì)著色的位置和著色深度的分析來(lái)使特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息獲得。

樣品制備

1、提取加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白：

一些細(xì)胞因?yàn)槭芩幬锏挠绊懨撀湎聛?lái)，因此還需要收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。

（1）在15ml離心管中倒入培養(yǎng)液，在2500rpm離心5分鐘。

（2）棄上清，將4ml PBS加入，并且用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5分鐘，棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。

（3）使用槍將上清洗干凈之后，將100 μL裂解液（含PMSF）加入，在冰上裂解30分鐘，為了使細(xì)胞充分裂解，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈。

（4）混合培養(yǎng)瓶中裂解液和裂解液，4℃、12000rpm離心5min，取上清，在0.5ml離心管中分裝，并且保存在零下20攝氏度下。

2.提取組織中總蛋白：

（1）在1～2ml勻漿器中球狀部位放置少量組織塊，組織塊使用干凈的剪刀盡量剪碎。。

（2）在勻漿器中將400 μL單去污劑裂解液加入進(jìn)行勻漿。然后在冰上放置。

（3）過(guò)幾分鐘，再碾一會(huì)兒在冰上放置，為了盡量碾碎組織，要重復(fù)碾幾次。

（4）裂解30 分鐘以后，就能夠使用移液器往1.5ml離心管中移入裂解液。之后在4攝氏度下12000rpm離心5分鐘，取上清在0.5ml離心管中分裝并且保存在－20℃下。

3.提取單層貼壁細(xì)胞總蛋白：

（1）將培養(yǎng)液倒掉，在吸水紙上倒扣瓶，使培養(yǎng)液被吸水紙吸干。

（2）將3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）分別加入到細(xì)胞瓶中，平放輕輕搖動(dòng)1分鐘，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，之后將洗液棄去，以上操作重復(fù)兩次，一共洗三次細(xì)胞來(lái)使培養(yǎng)液洗去，棄凈PBS后，在冰上放置培養(yǎng)瓶。

（3）裂解液每1毫升將10 μl PMSF（100mM）加入其中，搖勻在冰上放置。

（4）將400 μl含PMSF的裂解液分別加入到每瓶細(xì)胞中，在冰上裂解30分鐘，應(yīng)當(dāng)經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)培養(yǎng)瓶，從而使細(xì)胞充分裂解。

（5）裂解結(jié)束以后，將細(xì)胞用干凈的刮棒刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用槍往1.5ml離心管中移入裂解液和細(xì)胞碎片。

（6）提前開離心機(jī)預(yù)冷，在4攝氏度下12000rpm離心5分鐘。

（7）在多個(gè)0.5ml的離心管中分別移入離心后的上清，保存在零下20攝氏度下。