液相色譜儀流動相的選用要求包括流動相性質(zhì)要求、流動相選擇、流動相pH值、流動相脫氣、流動相過濾、流動相貯存、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問題和液相色譜儀用水等方面。

　　一、液相色譜儀流動相性質(zhì)要求

　　液相色譜儀中，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k值減小;較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附增加，相應(yīng)的容量因子k值增大。因此，k值是流動相組成的函數(shù)。理論塔板數(shù)一般與流動相的粘度成反比。

　　1、流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：

　　低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)，酸性流動相不能用于氧化鋁和氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

　　2、純度高：

　　液相色譜儀色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

　　3、必須與檢測器匹配：

　　當(dāng)使用UVD時(shí)，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收或吸收很小。

　　當(dāng)使用RID時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

　　4、粘度低：

　　高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散和傳質(zhì)，使柱效降低，還會使柱壓增加，分離時(shí)間延長。Z好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動相。

　　5、對樣品的溶解度要適宜：

　　如果溶解度欠佳，樣品會在色譜柱內(nèi)沉淀，不但影響純化分離，而且會使色譜柱惡化。

　　6、樣品易于回收：

　　液相色譜儀應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

　　二、液相色譜儀流動相選擇

　　液相色譜儀中，溶劑的洗脫能力與溶劑極性相關(guān)。

　　1、正相色譜的流動相：

　　在正相色譜中，溶劑強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加。

　　正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。

　　2、反相色譜的流動相：

　　在反相色譜中，溶劑強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。

　　反相色譜的流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑(如甲醇、乙腈和四氫呋喃等)。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小，價(jià)格低，是反相色譜Z常用的流動相。

　　乙腈-水系統(tǒng)與甲醇-水系統(tǒng)相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，可滿足在紫外185～205nm處檢測的要求，綜合來看，乙腈-水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。

　　在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，需采用梯度洗脫。

　　三、液相色譜儀流動相pH值

　　采用反相色譜分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動相pH值，以YZ樣品組分的解離、增加組分在固定相上的保留和改善峰形的技術(shù)，稱為反相離子YZ。

　　1、弱酸樣品：

　　對于弱酸樣品，流動相pH值越小，組分k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在。液相色譜儀分離弱酸樣品時(shí)，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液。

　　2、弱堿樣品：

　　對于弱堿樣品，情況與弱酸樣品相反。液相色譜儀分離弱堿樣品時(shí)，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

　　流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象，在這種情況下有機(jī)胺(如三乙胺)稱為減尾劑或除尾劑。

　　四、液相色譜儀流動相脫氣

　　1、流動相脫氣的原因：

　　液相色譜儀所用流動相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵工作、柱分離效率、檢測器靈敏度和基線穩(wěn)定性，甚至無法檢測。

　?、倭鲃酉嘀械娜芙庋蹩赡芘c樣品、流動相甚至固定相(如烷基胺)反應(yīng)。

　　②溶解氧會引起溶劑pH變化，給分析結(jié)果帶來誤差。

　　③溶解氧能與某些溶劑(如甲醇和四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收(特別是在260nm以下)，導(dǎo)致檢測靈敏度輕微降低，更重要的是在梯度洗脫時(shí)會造成基線漂移或形成鬼峰。除去溶解氧將大大提高UVD的性能。

　?、茉跓晒鈾z測中，溶解氧在一定條件下會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛和酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。除去溶解氧將改善在一些熒光檢測中的靈敏度。

　?、菰陔娀瘜W(xué)檢測中(特別是還原電化學(xué)法)，溶解氧的影響更大。

　　2、常用脫氣方法：

　　有吹氦脫氣法、加熱回留法、超聲波脫氣法、抽真空脫氣法和在線真空脫氣法等。

　　五、液相色譜儀流動相過濾

　　所有溶劑使用前都必須經(jīng)0.45μm或0.22μm濾膜過濾，以除去雜質(zhì)微粒。色譜純試劑也不例外，除非在標(biāo)簽上標(biāo)明已過濾。

　　用濾膜過濾時(shí)，要注意分清有機(jī)相(脂溶性)濾膜和水相(水溶性)濾膜。

　　有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時(shí)流速低或過濾不動。

　　水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑。否則濾膜會被溶解，溶有濾膜的溶劑不得用于液相色譜儀。

　　對于混合流動相，可在混合前分別過濾。如需混合后過濾，shou選有機(jī)相濾膜。現(xiàn)已有混合型濾膜。

　　六、液相色譜儀流動相貯存

　　流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因?yàn)樵S多有機(jī)溶劑(如甲醇和乙酸等)可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑被污染。這種被污染的溶劑如用于液相色譜儀，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，防止氧和二氧化碳溶入流動相。

　　磷酸鹽和乙酸鹽緩沖液很容易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新過濾。

　　容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的容器，以除去容器底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的容器無此現(xiàn)象。

　　七、鹵代溶劑應(yīng)特別注意的問題

　　1、鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與液相色譜儀中的不銹鋼反應(yīng)。

　　2、鹵代溶劑與水的混合物比較容易反應(yīng)，不能存放太久。

　　3、鹵代溶劑(如CCl4和CHCl3)等與各種醚類(如二異丙醚和四氫呋喃等)混合后，可能會反應(yīng)生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物，這種混合流動相應(yīng)盡量不采用或新鮮配制。

　　4、鹵代溶劑(如CH2Cl2)與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑(如乙腈)混合靜置時(shí)，會產(chǎn)生結(jié)晶。

　　總之，鹵代溶劑Z好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴混合，則不會產(chǎn)生類似問題。

　　八、液相色譜儀用水

　　液相色譜儀應(yīng)用中，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫要求用超純水。