手工測(cè)序以及自動(dòng)測(cè)序均屬于DNA序列測(cè)定，手工測(cè)序可分為maxam-gilbert化學(xué)降解法與sanger雙脫氧鏈終止法，事實(shí)上，目前dna序列分析的主流是自動(dòng)測(cè)序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號(hào)DNA測(cè)序儀均已經(jīng)被美國(guó)pe abi公司生產(chǎn)出來(lái)了，在這幾款DNA測(cè)序儀中，臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用Z多的一種型號(hào)要屬310型。

問(wèn)題與解答

怎樣選擇(設(shè)計(jì)）測(cè)序用引物?

答:測(cè)序用引物，和PR用引物不相同，有著非常嚴(yán)格的要求。PR用引物通常僅需可以與模板結(jié)臺(tái)端的幾個(gè)堿基完全配對(duì),就算引物長(zhǎng)度有80堿基,僅需對(duì)PCR反應(yīng)親件進(jìn)行調(diào)整，就可以使PCR反應(yīng)成功進(jìn)行，然而測(cè)序用引物卻不一樣，必須要對(duì)如下要求嚴(yán)格遵守。

1、GC含量應(yīng)當(dāng)選擇大約50%，對(duì)A、T、G、C的連續(xù)結(jié)構(gòu),盡可能避開(kāi)。

2、對(duì)引物二聚體結(jié)構(gòu)等復(fù)雜結(jié)枚或引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)避開(kāi)。

3、使引物和模板1**%匹配得以保證，尤其是必須1**%匹配3端的幾個(gè)堿基。同時(shí)必須使引物和模板之間只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)嚴(yán)格保證。

4、通常選擇20個(gè)堿基，按照GC含量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，大約15~25個(gè)堿基為其長(zhǎng)度。

5、3‘端盡可能選擇G或C堿基，從而使與模板的結(jié)合能力得以增加。

6、大約50℃~70℃應(yīng)當(dāng)為選擇的Tm溫度。

DNA測(cè)序樣品用什么溶液溶解比較好？

答:Z好使用滅菌蒸餾水對(duì)DNA測(cè)序樣品進(jìn)行溶解。

提供DNA測(cè)序樣品時(shí),提供何種形態(tài)的比較好?

 答:菌體被提供比較好，通過(guò)我們隊(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取，如此，能夠獲得比較穩(wěn)定的DNA樣品。然而樣品純度和數(shù)量必須值得注意。尤其是PCR產(chǎn)物為測(cè)序樣品時(shí)，應(yīng)當(dāng)對(duì)DNA的純度和數(shù)量特別留心。PCR產(chǎn)物應(yīng)該回收膠，不然的話，良好的測(cè)序效果不能夠獲得。

第三代測(cè)序技術(shù)效果：

1、它能夠達(dá)到999999%的精度，精度非常的高。

2、RNA序列能夠直接被測(cè)出來(lái)。

3、甲基化的DNA序列能夠直接被測(cè)出來(lái)。

4、它使DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度得以實(shí)現(xiàn)，10個(gè)堿基一秒就能夠測(cè)出來(lái)，測(cè)序速度2萬(wàn)倍于化學(xué)法測(cè)序。

5、它使得DNA聚合酶內(nèi)在自身的 processivity(延續(xù)性,也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段)實(shí)現(xiàn)了，非常長(zhǎng)的序列一個(gè)反應(yīng)就能夠測(cè)出來(lái)。上百個(gè)堿基能夠通過(guò)二代測(cè)序測(cè)出，然而幾千個(gè)堿基能夠通過(guò)三代測(cè)序測(cè)出。非常好的條件提供給了基因組的重復(fù)序列的拼接。

21世紀(jì)di一個(gè)十年里，DNA測(cè)序與生物云計(jì)算、個(gè)性化分子診斷、基因芯片、人類基因組計(jì)劃等等吸引無(wú)數(shù)眼球的熱門(mén)詞匯息息相關(guān)。在創(chuàng)意新天地里，生物技術(shù)和信息技術(shù)相互融合，相互作用，相互影響。

在業(yè)外人士眼里，DNA測(cè)序足以成為“一項(xiàng)新技術(shù)衍生出一個(gè)新行業(yè)”的典范，非常的高科技，國(guó)內(nèi)外VC和PE視之為寵兒，其在相當(dāng)短旳時(shí)間內(nèi)得到了非常迅猛的發(fā)展。它十年后的發(fā)展藍(lán)圖還沒(méi)有人能準(zhǔn)確描繪出來(lái)，由此可見(jiàn)其的發(fā)展速度的快速。所有預(yù)測(cè)相對(duì)于日新月異的DNA測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)均會(huì)顯得保守。