分子雜交（molecular hybridization）是指使單鏈核酸堿基序列確定的技術(shù)。待測(cè)單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過(guò)堿基配對(duì)使可檢出的雙螺旋片段形成為分子雜交的基本原理。下面就讓小編帶你了解一下以RNA為模板, 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針的方法。

概念：

對(duì)cDNA文庫(kù)中相應(yīng)的基因進(jìn)行分離是cDNA單鏈探針的主要作用。RNA為模板通過(guò)可用隨機(jī)引物或者用寡聚dT為引物兩種方式來(lái)使得cDNA探針合成。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈通過(guò)堿變性后，使得RNA單鏈被迅速地降解成小片段,經(jīng)Sephadex G-50柱層析就能夠使單鏈探針獲得。

合成cDNA探針?lè)椒ǎ?/span>

RNA為模板能夠通過(guò)以下兩種引物來(lái)合成cDNA探針。

1.可用隨機(jī)引物合成cDNA探針

這種方法使得用寡聚dT為引物合成cDNA探針的缺陷得以避免，能夠使產(chǎn)生的探針具有比較高的比活性。然而，因?yàn)橐话銜?huì)有很多不一樣的RNA分子包含于模板RNA中，和通過(guò)克隆DNA為模板所得的探針想比較，其所得的探針具有復(fù)雜的多的序列，因此，必須盡可能地對(duì)mRNA中的目的序列預(yù)先富集。

2.用寡聚dT為引物合成cDNA探針

僅僅在帶Poly(A)的mRNA的時(shí)候被使用，而且產(chǎn)生的探針對(duì)于mRNA 3'末端序列有極大的偏向。

操作準(zhǔn)備：

試劑 ：RNasin；10% SDS；0.5mol/L EDTA (pH8.0)；1mol/L KCl；250mmol/L MgCl2；100mmol/L DTT；反轉(zhuǎn)錄酶；[a-32P]dCTP；5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP以及適合的引物。

設(shè)備：恒溫水浴鍋，高速臺(tái)式離心機(jī)等。

材料：已經(jīng)提純的RNA或mRNA

操作步驟：

將Rnasin 20U，2.0ml 0.1mol/L DTT，10.0ml [a-32P]dCTP，10.0ml 5mmol/L dNTP,2.0ml 250mmol/L MgCl2,3.5ml 1mol/L KCl,2.5ml1mol/L Tris·Cl(pH7.6),10.0ml合適的產(chǎn)物以及10.0mlRNA或mRNA 加入到已置于冰浴中的滅菌離心管中，加水變成48ml的溶液，將2ml反轉(zhuǎn)錄酶加入到溶液中，混合均勻后稍稍離心，在37℃溫度下保溫2h。在反應(yīng)完成后將2ml的10% SDS以及2ml 的0.5mol/L EDTA (pH8.0)加入，再將3ml 3mol/L NaOH加入其中，加熱到68℃保溫半個(gè)小時(shí)來(lái)使得RNA被水解。冷卻到室內(nèi)溫度，將10ml 1mol/L Tris·Cl (pH7.4)加入混合均勻，然后再將3ml 2mol/L HCl加入。酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50柱層析或乙醇沉淀法來(lái)使標(biāo)記的探針?lè)蛛x。

注意事項(xiàng)

RNA非常容易降解，所以必須在DEPC處對(duì)實(shí)驗(yàn)中的所有試劑和器皿進(jìn)行處理，滅菌備用。