手工測序以及自動(dòng)測序均屬于DNA序列測定，手工測序可分為maxam-gilbert化學(xué)降解法與sanger雙脫氧鏈終止法，事實(shí)上，目前dna序列分析的主流是自動(dòng)測序。373型、377型、310型、3700和3100型等多種型號(hào)DNA測序儀均已經(jīng)被美國pe abi公司生產(chǎn)出來了，在這幾款DNA測序儀中，臨床檢測實(shí)驗(yàn)室使用Z多的一種型號(hào)要屬310型。

操作步驟

一、pcr測序反應(yīng)

1、取0.2ml的pcr管，用記號(hào)筆編號(hào)，在顆粒冰中插上pcr管，將2μl 滅菌去離子水、1μlm13(-21)引物、1μl 待測dna的正向引物、1μl pgem-3zf (+) 雙鏈dna、1μl 待測的質(zhì)粒dna、1μl bigdye mix加入，輕礦物油或石蠟油不添加，將pcr管蓋緊，用手指彈管混合均勻，稍稍離心。

2、在2400型或9600型pcr儀上放上pcr管進(jìn)行擴(kuò)增，在98℃下變性兩分鐘之后進(jìn)行pcr循環(huán)，60℃4min、50℃ 5s以及96℃ 10s為pcr的循環(huán)參數(shù)，經(jīng)歷25個(gè)循環(huán)，在完成擴(kuò)增以后將溫度設(shè)置為4℃保溫。

二、使用醋酸鈉/乙醇法對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化

1、離心混合物，往1.5ml ep管中轉(zhuǎn)移入擴(kuò)增產(chǎn)物。

2、將醋酸鈉/乙醇混合液 25μl加入，充分振蕩，放到冰上10分鐘來使得dna沉淀。12000r/min在4℃條件下離心半個(gè)小時(shí)，仔細(xì)棄上清。

3、將50μl70%(v/v)的乙醇加入，進(jìn)行2次洗滌沉，12000r/min在4℃條件下離心5分鐘，仔細(xì)棄上清以及管壁的液珠，再經(jīng)過10到15分鐘的真空干燥沉淀。

三、電泳前處理測序pcr產(chǎn)物

1、在離心管中將12μl tsr加入，劇烈振蕩，，使其充分溶解，沉淀dna，稍稍離心。

2、往蓋體分離的0.2ml pcr管中轉(zhuǎn)移入溶液，稍稍離心。

3、熱變性(95℃ 2min)在pcr儀上進(jìn)行，在冰中迅速降溫，等待上機(jī)。

四、將彩色測序圖譜分析或打印出來

毛細(xì)管根據(jù)儀器操作說明來進(jìn)行安裝，校正毛細(xì)管位置，人工手動(dòng)灌膠和將運(yùn)行的測序順序文件建立。儀器將往毛細(xì)管中自動(dòng)灌膠，1.2kv預(yù)電泳5分鐘，根據(jù)編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2kv，20min)，在7.5kv下電泳兩個(gè)小時(shí)。完成電泳以后，儀器會(huì)自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。兩個(gè)半小時(shí)為每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間，儀器會(huì)在完成電泳以后將彩色測序圖譜分析或打印出來。

五、序列分析

儀器能夠進(jìn)行自動(dòng)序列分析，并且能夠按照用戶要求進(jìn)行序列比較。

六、清洗與保養(yǎng)儀器

清洗與保養(yǎng)工作在根據(jù)操作規(guī)程對(duì)儀器測序完畢以后進(jìn)行。

現(xiàn)狀和意義

在業(yè)外人士眼里，DNA測序足以成為“一項(xiàng)新技術(shù)衍生出一個(gè)新行業(yè)”的典范，非常的高科技，國內(nèi)外VC和PE視之為寵兒，其在相當(dāng)短旳時(shí)間內(nèi)得到了非常迅猛的發(fā)展。它十年后的發(fā)展藍(lán)圖還沒有人能準(zhǔn)確描繪出來，由此可見其的發(fā)展速度的快速。所有預(yù)測相對(duì)于日新月異的DNA測序技術(shù)來說均會(huì)顯得保守。

有50余個(gè)研究小組在威康信托基金會(huì)中，其是英國Zda的生物醫(yī)學(xué)資助機(jī)構(gòu)之一。雙向障礙病、冠心病、克羅恩氏病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓以及I型糖尿病和II型糖尿病等多疾病的基因的篩查這一項(xiàng)頗具野心的龐大計(jì)劃和挑戰(zhàn)由他們在過去的幾年開展了。有24處與上述7種疾病相關(guān)的位點(diǎn)通過對(duì)1.7萬名英國人的SNPs篩查分析，在基因組中被找到，有10個(gè)致病基因在II型糖尿病的篩查中被找到和證實(shí)。

從前將致病相關(guān)基因從數(shù)萬個(gè)人類基因中篩選出來猶如大海撈針。為了對(duì)這個(gè)基因究竟在何處想方設(shè)法的定位，科學(xué)家需要對(duì)同一個(gè)家族的多位患者的標(biāo)本進(jìn)行獲取。設(shè)計(jì)高通量藥物，致病或抑病基因的鑒定、疾病易感人群的篩查甚至個(gè)性化YL由于具備了如今快速測序技術(shù)和SNPs這個(gè)強(qiáng)有力的工具而不再是需要向往的事。