紫外交聯(lián)儀的主要用途為在膜上交聯(lián)核酸，其是一種254mm紫外輻射系統(tǒng)，其有很多用途，UV滅菌消除PCR污染、嘧啶二聚體產(chǎn)生的部分限制性內(nèi)切酶消化、RecA突變篩選以及瓊脂糖凝膠中DNA的切割等亦是其用途。其的應(yīng)用價(jià)值也體現(xiàn)在聚合物紫外處理和紫外滅菌等方面。以下為紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)原理和步驟。

原理：

和非取代的DNA相比較，含有如溴脫氧尿苷胸苷鹵代物的DNA對(duì)于紫外線誘導(dǎo)的交聯(lián)有著更高的敏感性。

儀器：

1、紫外透射儀 2、水浴鍋  3、 圓底0.5 mL 4、螺旋蓋的小瓶

5、DEAE膜

試劑：

14C標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物、Fluor、SDS樣品緩沖液×2、1U 微球菌核酸酶、DNA酶I 、CaCl2 0.5 mol/L、大分子載體DNA、經(jīng)緩沖的含有DNA結(jié)合蛋白的提取液、TE緩沖液、1**%乙醇、乙酸銨、25U 大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、二硫蘇糖醇 0.lmol/L、dNTP BrdU 溶液×50、[α32P] dCTP 3000 Ci mmol、10×與1×限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液以及M13通用引物17bp。

步驟

1、混合10μL含有高親和性蛋白結(jié)合位點(diǎn)的目的序列的單鏈M13載體和等摩爾的17 bp M13通用引物，使用1×限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液調(diào)節(jié)終體積到100μL。在90攝氏度下加熱5分鐘。在室溫下冷卻、

2、在雜交混合物中加入Klenow 酶 5μL、水7μL、10×限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液7.5μL、0.1 mol/L 二硫蘇糖醇1.75μL、50× dNTP/BrdU 溶液 3.5μL、[α32P] dCTP50μ等反應(yīng)物，在16攝氏度下溫浴90分鐘。

3、在68攝氏度下加熱10分鐘，將Klenow 酶滅活。

4、使用40U限制性內(nèi)切核酸酶在合適條件下消化，使得20600 bp的DNA片段產(chǎn)生。

5、將乙酸銨添加到0.3 mol/L，DNA使用2倍體積的1**%乙醇進(jìn)行沉淀，在TE緩沖液中重懸。

6、電泳在含有0.5μg/mL溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行。所要的DNA片段使用DEAE膜進(jìn)行分離。

7、BrdU取代的DNA片段的特異活性使用閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)，DNA的濃度的估計(jì)采用溴化乙錠點(diǎn)跡定量法。能夠采用遷移率變動(dòng)DNA結(jié)合分析法來(lái)檢測(cè)探針的完整性和功能。

8、將下列結(jié)合反應(yīng)建立于1.5 mL圓底小瓶中：將10-20μg DNA 載體、經(jīng)緩沖的含有結(jié)合蛋白的提取液以及105cpm均衡標(biāo)記的探針混合，調(diào)節(jié)總體積到50μL。瓶口使用塑料薄膜封住，固定再采用Parafilm膜加封。

9、在試管架上放上小瓶，于正上方5厘米處使用倒置的紫外透射燈照射1個(gè)小時(shí)。

10、將1U微球菌核酸酶、DNA 酶 I 4μg、0.5 mol/L CaCl2 1μL等反應(yīng)物加入到各結(jié)合反應(yīng)管中，在37攝氏度下消化半個(gè)小時(shí)。

11、在反應(yīng)混合物中加入等體積的2×SDS樣品緩沖液，在100攝氏度中煮沸5分鐘。

12、樣品的電泳在適當(dāng)濃度的不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。

13、完成電泳之后，將凝膠前沿的染料切去。

14、干膠，使用增感屏放射自顯影13日，來(lái)對(duì)交聯(lián)的蛋白質(zhì)進(jìn)行觀測(cè)。